一、检测原理的总体框架

Varioskan Flash 的检测原理基于光与物质的相互作用。当光束照射到样品时，样品中的分子会对光发生吸收、散射、发射等效应。仪器通过精确的光源控制系统、波长选择组件、样品定位结构和高灵敏度探测器，对这些光学变化进行定量测量，从而反映出样品的浓度、反应速率或其他物理化学性质。

主要检测模式包括：

1. 吸光度检测（Absorbance）：测量样品对特定波长光的吸收强度。

2. 荧光检测（Fluorescence）：测量样品在特定激发光作用下的发射光信号。

3. 发光检测（Luminescence）：测量样品自身化学反应或生物反应产生的光信号。

二、光学系统构成

1. 光源

• 氙灯光源：宽光谱范围（200–1000 nm），适合紫外到近红外检测，输出稳定，能量覆盖均匀。

• LED 光源（部分型号）：单色性好、寿命长、能耗低，适合特定波长检测。

2. 波长选择

• 采用单色器（Monochromator）或滤光片系统，选择所需的窄带波长光束。

• 波长步进可达 1 nm，可精确定位吸收峰或激发/发射峰。

3. 样品托盘与光路

• 支持标准 96 孔、384 孔微孔板及比色皿。

• 光路设计确保光束垂直穿过样品孔，减少光散射。

4. 探测器

• 吸光度模式：光电二极管（Photodiode），响应线性范围大、稳定性高。

• 荧光模式：光电倍增管（PMT），具有高灵敏度和低噪声特性，适合检测弱光信号。

• 发光模式：PMT 直读，无需激发光源，信噪比极高。

三、吸光度检测原理

1. 物理基础
   吸光度检测基于比尔–朗伯定律（Beer–Lambert Law）：

   $$A=\epsilon \cdot c\cdot l$$

   其中，A 为吸光度，ε 为摩尔吸光系数，c 为浓度，l 为光程长度。

2. 测量方法

• 光源发出光，经过单色器选定波长后进入样品。

• 样品对光进行吸收，透射光被探测器接收。

• 仪器计算入射光强 I0I_0I0 与透射光强 $I$ 的比值，得出吸光度：

  A=−log⁡10(I/I0)A = -\log_{10}(I/I_0)A=−log10(I/I0)

3. 应用示例

• ELISA 终点法检测（OD450 nm）

• 核酸定量（OD260）和纯度评估（OD260/OD280）

• 蛋白质定量（Bradford、BCA 等比色法）

四、荧光检测原理

1. 激发与发射
   荧光检测利用样品分子吸收短波长光（激发光）后跃迁到激发态，再返回基态时发射出较长波长光（发射光）的特性。激发光与发射光之间的波长差称为斯托克斯位移（Stokes Shift）。

2. 光路设计

• 光源发出激发光，通过激发滤光片进入样品孔。

• 样品发出的荧光经过发射滤光片进入 PMT 探测器。

• 滤光片系统保证激发光不会直接进入探测器，从而减少背景干扰。

3. 关键参数

• 激发波长（Ex）与发射波长（Em）的选择必须匹配荧光分子的光谱特性。

• 检测灵敏度依赖于 PMT 增益、积分时间以及光学系统的透光效率。

4. 应用示例

• 荧光标记抗体检测

• DNA/RNA 荧光染料检测（SYBR Green、PicoGreen）

• 细胞内钙离子检测（Fura-2 比值法）

五、发光检测原理

1. 化学发光
   样品在化学反应中产生激发态分子，这些分子回到基态时释放光子。反应通常不需要外部光源，背景噪声极低。

2. 生物发光
   由生物酶催化底物反应产生光信号，例如萤火虫荧光素酶（Luciferase）与荧光素（Luciferin）反应。

3. 检测方式

• 由于不需要激发光源，光学系统结构更简单，信号直接由 PMT 接收。

• 适合超低光信号检测，动态范围宽。

4. 应用示例

• 化学发光免疫分析（CLIA）

• ATP 含量测定

• 荧光素酶报告基因检测

六、信号处理与数据计算

1. 模数转换（ADC）
   探测器产生的模拟电信号经高精度模数转换器转化为数字信号。

2. 背景扣除
   使用空白对照孔的信号值扣除样品的背景光或电子噪声，提高结果准确性。

3. 双波长计算
   主波长用于检测信号，参考波长用于校正光散射、浊度等干扰：

   Aresult=Aλ1−Aλ2A_{\text{result}} = A_{\lambda_1} - A_{\lambda_2}Aresult=Aλ1−Aλ2

4. 标准曲线拟合
   对定量实验，通过测量标准品信号值绘制标准曲线，并利用拟合方程计算未知样品浓度。

七、影响检测精度的关键因素

1. 光源稳定性
   光强波动会直接影响吸光度和荧光强度的重复性。

2. 波长准确性
   波长选择偏差会导致信号降低或检测灵敏度下降。

3. 样品处理
   气泡、沉淀物和不均匀分布会增加光散射，引入误差。

4. 微孔板质量
   板底透明度、平整度和材质会影响光的透射效率和一致性。

5. 温控条件
   对温度敏感的反应（如酶动力学），温度波动会改变反应速率，从而影响信号稳定性。

八、综合优势

1. 多模式集成
   同一台设备即可实现吸光度、荧光、发光三种主要检测模式，减少设备投资与空间占用。

2. 宽波长范围与高分辨率
   从 200 nm 到 1000 nm 的全光谱覆盖，波长步进精确到 1 nm，适应多种检测需求。

3. 高灵敏度与宽动态范围
   既能检测极低浓度的弱信号，也能保持高浓度样品的线性响应。

4. 灵活的软件控制
   搭配 SkanIt Software，可灵活设定检测模式、波长、读数方式，并自动进行数据分析与报告生成。

九、总结

赛默飞酶标仪 Varioskan Flash 的检测原理融合了精密光学、电子探测和数字信号处理技术，通过吸光度、荧光和发光三大模式，实现了从基础定量分析到高灵敏度痕量检测的全覆盖。其光学系统稳定、波长控制精确、探测器灵敏度高，并配合智能化软件，能够为科研和应用检测提供快速、准确、可重复的数据支持。理解这些检测原理，不仅有助于正确选择实验模式和参数，还能帮助用户优化实验设计，提升数据质量和实验效率。