一、OD 值测定的基本概念

1. OD 值的定义
   OD（Optical Density，光密度）值是样品对光的吸收程度的定量表示，一般通过吸光度（A）公式计算：

   A=−log⁡10(II0)A = -\log_{10} \left( \frac{I}{I_0} \right)A=−log10(I0I)

   其中，I0I_0I0 为入射光强度，$I$ 为透过样品后的光强度。

2. 物理意义
   OD 值反映了样品溶液中溶质（分子、细胞或颗粒物）的浓度或含量。在一定范围内，OD 值与浓度成正比（比尔–朗伯定律）。

3. 常用波长

• 微生物生长监测：OD600（600 nm 波长）

• 核酸定量：OD260（260 nm 波长）

• 蛋白质定量：OD280（280 nm 波长）

• 比色法测定：根据底物或显色产物的吸收峰选择特定波长（如 ELISA 常用 450 nm）

二、Varioskan Flash 的 OD 测定原理

1. 光源与波长选择

• 配备宽光谱氙灯，波长范围 200–1000 nm，可满足紫外到近红外的检测需求。

• 通过单色器实现 1 nm 步进 的波长精确选择，既可单波长测定，也可双波长或全光谱扫描。

2. 光路设计

• 光源发出的光经单色器选定波长后，垂直穿过微孔板中样品液体。

• 样品吸收光子，透射光强减弱，由探测器测得透射光强度。

• 仪器通过计算公式将透射光强换算为 OD 值。

3. 探测器

• 使用高灵敏度光电二极管，能准确检测从强信号到极弱信号的透射光强变化。

• 背景噪声低，线性范围宽，保证 OD 值的准确性。

4. 双波长扣除背景

• 主波长测定目标信号，参考波长扣除浊度、气泡或容器光学特性带来的背景影响。

三、硬件与耗材要求

1. 微孔板选择

• 透明板：用于可见光吸光度检测（OD600、OD450 等）

• 石英板：用于紫外波段检测（OD260、OD280）

• 平底板：适合光路垂直检测，避免光散射

• 高透光率板：减少光损耗，提升信噪比

2. 样品准备

• 样品体积需满足仪器光路要求（通常 200 µL 左右，视微孔板规格而定）

• 样品应混匀、无气泡，防止光散射造成 OD 偏高

四、OD 值测定操作流程

1. 开机与预热

• 启动 Varioskan Flash，预热光源数分钟，保证光强稳定

2. 微孔板准备

• 将样品加至微孔板中，每孔体积一致

• 设置空白对照孔（溶剂或缓冲液）

3. 软件设置

• 在 SkanIt Software 中建立新方法

• 选择 Absorbance 模式

• 设置主波长（如 600 nm）和参考波长（可选，如 750 nm）

• 定义读板顺序（行或列扫描）

• 若为动力学实验，设置读取间隔与总时间

4. 检测与数据采集

• 将微孔板置入载板托盘

• 启动测定，仪器自动逐孔采集透射光信号并计算 OD 值

• 数据实时显示在软件界面

5. 数据保存与导出

• 保存实验数据至内部存储或直接导出到计算机

• 导出格式可为 CSV、Excel、PDF 等

五、常见 OD 测定应用

1. 微生物生长曲线

• 在恒温培养条件下，定时测量 OD600，绘制细菌或酵母的生长曲线，判断对数期、稳定期等阶段。

2. ELISA

• 读取比色反应产物在特定波长下的吸光度（如 450 nm），用于定量分析抗原或抗体。

3. 核酸/蛋白质定量

• OD260 用于 DNA、RNA 浓度计算，OD280 用于蛋白质浓度估算，OD260/OD280 比值用于纯度评估。

4. 酶动力学研究

• 通过连续读取 OD 值，计算反应速率，分析酶活性与底物浓度关系。

六、影响 OD 测量精度的因素

1. 光源稳定性
   光源输出波动会直接导致 OD 值不稳定，应在测定前预热光源。

2. 样品质量

• 气泡、沉淀、颗粒会增加光散射

• 样品混匀不足会导致孔间差异

3. 微孔板质量

• 板底不平整、透光性差会引入误差

• 划痕或污渍会影响光路

4. 背景扣除
   若未设置合适的空白对照或参考波长，背景噪声会导致 OD 偏高或波动大。

七、数据处理与分析

1. 空白校正

   Acorrected=Asample−AblankA_{\text{corrected}} = A_{\text{sample}} - A_{\text{blank}}Acorrected=Asample−Ablank

2. 浓度计算
   通过标准曲线（浓度-OD 值）拟合方程，计算未知样品浓度。

3. 双波长扣除背景

   Aresult=Aλ1−Aλ2A_{\text{result}} = A_{\lambda 1} - A_{\lambda 2}Aresult=Aλ1−Aλ2

   有效减少浊度和光学干扰影响。

4. 生长速率计算
   对时间序列的 OD 数据取对数并作线性拟合，斜率即为比生长速率。

八、优化 OD 测定的建议

1. 样品处理

• 检测前充分混匀

• 避免气泡，必要时可轻拍板底排泡

2. 板型选择

• 选择与检测波长相适应的微孔板材质

• 使用光学性能一致的同批次微孔板

3. 参考波长设置

• 对于含有颗粒或浊度的样品，使用双波长模式提升精度

4. 软件方法保存

• 将常用测定方法保存为模板，减少人为输入错误

九、总结

Varioskan Flash 具备高稳定性光源、精准波长选择、高灵敏探测器及灵活的软件控制，使其在 OD 值测定中能实现快速、准确、可重复的结果。通过合理选择波长、优化样品准备、使用合适的板型和参考波长设置，可以显著提高测定精度。无论是用于微生物生长监测、ELISA 检测，还是核酸/蛋白质定量，Varioskan Flash 都能够提供可靠的数据支持，为实验室科研与应用检测提供强有力的保障。