一、光程校正的概念与原理

1.1 光程的定义

光程（Pathlength）是指光在样品中传播的实际距离。在吸光度检测中，光程的长度会影响吸光度的测量结果，这是因为吸光度与光程成正比（比尔-朗伯定律）。
比尔-朗伯定律公式为：

$$A=\epsilon \cdot c\cdot l$$

其中：

• $A$ ：吸光度

• $\epsilon$ ：摩尔吸光系数

• $c$ ：样品浓度

• $l$ ：光程长度

1.2 光程差异的来源

在使用微孔板检测时，每个孔内样品的体积可能不同，导致液体高度（即光程长度）存在差异。此外，不同类型微孔板（如96孔、384孔）的孔深也会不同，因此即使浓度相同，吸光度也会有偏差。

1.3 光程校正的原理

光程校正的核心思想是通过已知光程参考信号，将实际测得的吸光度值换算到标准光程（通常是1 cm）下的吸光度，从而使不同体积、不同孔型下的结果具有可比性。
Varioskan Flash通常利用水在特定波长下的已知吸光系数来计算光程，从而实现校正。

二、光程校正的必要性

1. 保证数据可比性
   不同孔型、不同加样体积会导致光程不同，未经校正的吸光度值无法直接比较。

2. 减少系统误差
   光程不一致会引入系统性偏差，尤其在进行定量分析时影响较大。

3. 适配多孔板检测
   在高通量检测中，经常会混用不同规格的微孔板，光程校正确保数据标准化。

4. 提高浓度计算准确度
   在利用标准曲线计算样品浓度时，光程校正可以让计算基于统一的光程，提高浓度结果的准确性。

三、Varioskan Flash的光程校正实现方式

3.1 基于水吸收峰的校正

Varioskan Flash采用一种常见的光程测定方法：

• 在水的近红外吸收峰（约900 nm和975 nm）处测量吸光度。

• 根据水在该波长下的摩尔吸光系数，结合测得的吸光度计算液体高度，从而得到实际光程。

• 将实际光程换算为等效的1 cm标准光程下的吸光度值。

3.2 自动化计算

配合SkanIt软件，Varioskan Flash可以自动执行光程校正，无需用户手动计算：

1. 检测样品吸光度

2. 同时检测水峰吸光度

3. 自动计算光程并进行结果换算

3.3 多孔板适配

无论是96孔板还是384孔板，Varioskan Flash都能根据每个孔的样品高度独立计算光程，从而实现单孔级别的精准校正。

四、光程校正的操作步骤（参考流程）

1. 准备样品

• 使用去离子水或缓冲液作为空白对照

• 确保加样体积符合实验设计

2. 在SkanIt软件中设置光程校正

• 选择吸光度检测模式

• 启用“光程校正（Pathlength Correction）”选项

• 设置参考波长（如900 nm和975 nm）

3. 运行检测

• 软件会自动在参考波长处测量吸光度并计算光程

4. 查看结果

• 软件会显示已校正的吸光度值（等效于1 cm光程）

• 同时保留原始未校正数据以供对比

五、应用场景

5.1 核酸和蛋白质定量

在核酸（A260）或蛋白质（A280）定量中，光程校正可避免加样体积差异导致的浓度误差。

5.2 酶动力学测定

在动力学曲线的速率计算中，光程校正确保不同孔的数据可直接比较，提高动力学参数（如Vmax、Km）的准确性。

5.3 多批次实验对比

当不同批次实验使用的微孔板深度或样品体积不一致时，光程校正可消除物理差异的影响。

5.4 高通量筛选（HTS）

在自动化高通量平台中，样品体积变化不可避免，光程校正能保障数据的统一性。

六、影响光程校正精度的因素

1. 液体纯度
   水峰法依赖水在近红外的吸收特性，如果缓冲液或样品中含有会在该波长吸收的成分，会影响光程计算。

2. 微孔板透光性
   材质、颜色、质量都会影响测得的吸光度，从而影响光程计算精度。

3. 温度变化
   水的吸收系数与温度相关，剧烈的温度变化可能导致光程测定值偏差。

4. 加样精度
   液面高度直接影响光程，如果加样体积差异过大，会导致数据波动。

七、优化光程校正效果的建议

1. 使用高质量微孔板
   选择透光率高且一致性好的透明微孔板，减少孔间差异。

2. 保持温度稳定
   在恒温条件下进行检测，尤其是光程校正步骤。

3. 合理选择缓冲液
   避免在参考波长处有较强吸收的缓冲液成分。

4. 定期校准仪器
   保证光源和检测器性能稳定，提高光程计算的可靠性。

5. 加样一致
   使用高精度移液器，减少体积误差。

八、光程校正与比色皿测量的关系

比色皿的光程通常固定为1 cm，因此在比色皿测量中无需光程校正。但在微孔板测量中，由于光程短且可变，光程校正是使微孔板数据与比色皿数据可比的关键。
Varioskan Flash通过光程校正功能，使得微孔板测量结果可以直接与比色皿结果对应，从而让研究人员在高通量条件下也能获得与传统方法一致的结果。

九、结论

Varioskan Flash的光程校正功能是确保微孔板吸光度测量准确性和可比性的重要技术。它基于水在近红外波段的吸收特性，通过自动计算样品光程并将数据换算到标准光程，实现不同孔型、不同体积条件下结果的标准化。
该功能在核酸定量、蛋白质测定、酶动力学研究以及高通量筛选等领域具有重要意义，可以有效减少因物理条件差异引起的系统误差，为科学研究和检测提供更加可靠的数据支持。