赛默飞酶标仪Multiskan Ascent试验方法

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赛默飞酶标仪 Multiskan Ascent 试验方法

一、设备与原理概述

赛默飞（Thermo Scientific）Multiskan Ascent 是一款专为微孔板检测设计的全自动酶标仪，广泛应用于生命科学研究、临床诊断、食品检测、药物筛选等领域。它通过光吸收法测量样品在特定波长下的吸光度，根据比尔–朗伯定律将吸光度转换为浓度或活性指标。

光学系统采用高精度干涉滤光片配合稳定光源，结合光电探测器与数据处理模块，可实现单波长、双波长、终点法、动力学等多种测量模式。

二、试验前准备

1. 仪器检查

电源与接口：确认电源线、串口/USB 连接线完好。
光源状态：光源点亮正常，无闪烁现象。
滤光片：波长配置与试验需求匹配，无划痕、污染。
微孔板托盘：无残留物，运动平稳。

2. 环境要求

室温保持在 20–25℃，湿度 40–60%。
避免阳光直射、强气流和振动源。

3. 试剂与耗材

试验所需试剂（底物、显色剂、缓冲液等）。
标准品或对照品。
高质量微孔板（透明、平底或其他适配类型）。

4. 软件与方法设置

在 Multiskan Ascent 软件中建立试验模板，设定波长、检测模式、测量时间等。

三、试验类型与具体方法

（一）ELISA 试验方法

实验原理
ELISA 通过抗原–抗体特异性结合，并在酶催化下生成有色产物。产物的吸光度与待测物质浓度成比例。
操作流程

包被：将抗原或抗体加入微孔板，孵育后洗板。
封闭：加入封闭液，阻断非特异性结合位点。
加样：加入待测样品或标准品，孵育后洗板。
加酶标二抗：孵育结合后洗板。
显色：加入底物（如 TMB），在设定时间内显色。
终止反应：加入终止液（如 H₂SO₄）。

测量条件

主波长：450 nm
参考波长：620 nm（可选）
模式：单次终点测量

数据处理

扣除空白孔吸光度。
用标准品吸光度绘制标准曲线（4PL 或线性）。
计算样品浓度。

（二）蛋白定量试验

常用方法包括 Bradford 法 和 BCA 法。

Bradford 法

原理：考马斯亮蓝 G-250 染料与蛋白结合后吸收峰从 465 nm 转移至 595 nm。
步骤：
数据处理：绘制标准曲线，计算样品浓度。

配制标准蛋白溶液。
样品与试剂混合，室温反应 5–10 分钟。
在 595 nm 测量吸光度。

BCA 法

原理：蛋白在碱性条件下还原 Cu²⁺ 为 Cu⁺，与 BCA 反应生成紫色络合物（562 nm）。
步骤：

配制工作液（BCA 试剂 + Cu²⁺ 溶液）。
样品与工作液混合，37℃ 反应 30 分钟。
在 562 nm 测量吸光度。

（三）酶动力学试验

原理
测量底物转化为产物的速率，计算酶活性。
步骤

在孔中加入底物与酶混合物。
在软件中设置连续测量，每隔 15–30 秒读取一次吸光度，持续 3–10 分钟。
常用波长根据底物显色特性选择（如 405 nm）。

数据处理

绘制吸光度–时间曲线。
计算曲线斜率（ΔA/Δt），换算为酶活性单位。

（四）细胞活性检测

MTT 法

原理：线粒体酶将 MTT 还原为紫色甲瓒晶体（570 nm）。
步骤：

细胞加 MTT 溶液孵育 4 小时。
加入溶解液溶解甲瓒晶体。
在 570 nm 测量吸光度。

WST-1 法

原理：可溶性产物直接在 450 nm 检测，操作简便。
步骤：细胞加 WST-1 溶液，孵育 1–2 小时直接读数。

四、数据采集与分析

空白扣除

空白孔（不含待测物）用于消除试剂本底影响。

标准曲线拟合

选择合适的拟合方式（线性、4PL、5PL）。

双波长修正

主波长检测信号，参考波长消除浊度和背景。

统计分析

计算平均值、标准差、变异系数（CV）。

五、质量控制

试剂质量

使用在有效期内的试剂，避免重复冻融。

设备校准

定期进行波长和吸光度精度校准。

实验重复

每个样品至少平行重复两次以上。

控制样本

每批实验中加入阳性和阴性对照。

六、常见问题与解决方法

问题	可能原因	解决方法
吸光度偏高	样品浓度过高、光程污染	稀释样品、清洁微孔板
信号漂移大	光源不稳、温度波动	检查光源、保持恒温
重复性差	操作不一致、加样误差	使用多道移液器、标准化操作
波长检测错误	滤光片错位或老化	检查并更换滤光片

七、安全注意事项

在实验过程中佩戴实验室防护用品（手套、护目镜、实验服）。
操作含有潜在生物风险的样品时，应在生物安全柜内完成加样与封板步骤。
设备维修和内部清洁需切断电源。
底物显色和终止液可能具有腐蚀性，应小心操作。

八、总结

Multiskan Ascent 酶标仪的试验方法涵盖了从免疫检测到酶活性分析、从蛋白定量到细胞活性评估的多种应用。掌握设备的操作逻辑、波长选择原则、检测模式设置以及数据处理方法，能够显著提高实验的准确性与重复性。在实际工作中，应结合试剂说明书和实验需求灵活调整方法，并保持严格的质量控制和安全防护，以充分发挥仪器性能并获得可靠的实验结果。

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