一、Multiskan EX酶标仪概述

Multiskan EX是Thermo Scientific公司推出的经典型多功能酶标仪，具有良好的光学灵敏度和稳定性。其核心特点如下：

• 波长范围广：具备340–850 nm波长选择功能，支持多种比色分析。

• 适配96孔板：广泛兼容标准96孔酶标板，可实现多孔同时检测。

• 多模式读取：包括终点法、动力学法和多波长扫描。

• 数据接口清晰：可与专用软件如Ascent Software连接进行数据采集与分析。

在进行**动力学检测（Kinetic Measurement）**时，该设备可实时追踪反应过程中吸光度的变化，适用于各类动态反应体系。

二、动力学检测原理

动力学检测是指在特定时间间隔内，连续读取样本吸光度的变化情况，用以分析反应速度、反应物浓度变化或酶活性。其原理基础包括：

• 朗伯-比尔定律：吸光度（A）与物质浓度（c）成正比。

• 连续测读：设备在设定时间间隔内多次测定A值，形成吸光度-时间曲线。

• 数据拟合：通过一阶、零阶或Michaelis-Menten模型拟合曲线，计算反应速率常数或Vmax等指标。

常见应用包括：

• 酶促反应速率测定（如HRP/TMB反应）

• 细胞代谢速率变化检测

• 药物溶出曲线分析

• 代谢物转化反应

三、动力学实验前准备

1. 仪器检查与校准

• 打开设备，运行预热程序；

• 确认光源工作正常，无漂移现象；

• 使用空白板或标准OD板进行初步校准；

• 校准波长位置（常用405、450、490、620nm等）是否清晰稳定。

2. 软件准备（以Ascent Software为例）

• 打开软件，选择新建动力学实验；

• 设置基本信息，如实验名称、操作人、板型；

• 确定读取孔位，定义空白孔、对照孔、样本孔；

• 保存模板设置，便于后续重复使用。

3. 实验板准备

• 使用标准96孔酶标板；

• 保证液体体积一致（通常100–200μl）；

• 避免气泡和液面不均；

• 用盖板或封板膜覆盖，减少蒸发影响。

四、动力学检测参数设置

以下为关键设置步骤：

五、标准动力学实验流程

Step 1：实验体系设计

以酶活性检测为例，实验组设定如下：

• 空白组（Buffer + 显色底物）

• 阴性对照（无酶组）

• 阳性对照（标准酶）

• 待测样品组（含不同处理条件样本）

Step 2：试剂加样

• 在冰上准备各组混合体系；

• 快速、准确加入显色底物（如TMB、ONPG等）；

• 确保所有孔加样时间一致，建议使用8/12道移液器。

Step 3：启动读取程序

• 放入酶标板，启动读取；

• 仪器按照设定时间间隔自动记录吸光度；

• 实时显示反应曲线（A值 vs 时间）。

Step 4：数据导出与分析

• 检测结束后导出.csv或.xlsx格式数据；

• 可选择软件自带拟合功能，或导入Excel/GraphPad Prism进行处理；

• 提取斜率（ΔA/min）作为反应速率；

• 建立浓度-反应速率标准曲线，计算样本活性。

六、动力学数据分析方法

1. 斜率法（Linear Slope）

• 取吸光度在反应线性区的时间点；

• 利用线性回归计算每孔的反应斜率；

• 单位常用为“OD/min”或“ΔA/min”。

2. 微分法

• 适用于不稳定反应；

• 计算每两个连续时间点吸光度变化率；

• 可观察反应启动期、线性期、饱和期过程。

3. Michaelis-Menten拟合（高级分析）

• 使用一组底物浓度设定多组反应体系；

• 提取Vmax、Km等参数，评价酶反应动力学特征。

4. 统计处理

• 每组设置重复孔（建议≥3个）；

• 计算平均值 ± 标准差；

• 通过t检验或ANOVA分析显著性差异。

七、动力学检测应用案例

案例一：乳酸脱氢酶（LDH）活性检测

• 波长设定：340 nm（NADH吸收峰）

• 检测时间：15分钟，每30秒采集一次

• 数据分析：计算NADH吸光度下降速率

案例二：细胞增殖动态监测（MTT法）

• 波长设定：570 nm

• 时间间隔：每小时一次，共检测8小时

• 应用说明：可实现细胞生长速率建模与药效评估

案例三：药物释放曲线分析

• 在不同时间点监测释放体系中的OD值

• 分析药物释放速度与载体释放机制

• 可进一步建模Higuchi、Korsmeyer-Peppas等释放模型

八、常见问题及处理建议

九、优化建议与实验标准化

1. 反应线性区选取

• 对于速率分析，应只取吸光度变化在0.1–0.8区间内的数据；

• 超过此范围可能存在底物耗尽或光学饱和。

2. 温度控制建议

• 保持实验环境温度恒定（通常室温20–25℃）；

• 或在温控孵育器中加样后立即转入酶标仪读取；

• 避免边缘效应导致孔间误差。

3. 板面封闭处理

• 长时间动力学实验中，建议使用透明封板膜封闭；

• 减少蒸发和污染风险，提升数据稳定性。

4. 数据重复与批间一致性

• 每孔检测建议重复3–6次；

• 同一实验在不同时间重复时需使用同批试剂；

• 制定详细SOP并记录每次参数设置、操作人及试剂批次。

十、总结

Multiskan EX酶标仪的动力学检测功能为各种生化与细胞实验提供了精准、实时的动态响应数据，是开展高质量酶学分析与药物动力学研究的重要工具。通过科学设计实验方案、合理设置参数、规范操作流程并精确处理数据，可极大提高检测的准确性与重复性。

无论是对经典酶反应（如ALP、LDH）、还是复杂反应体系（细胞毒性、药物释放），Multiskan EX都展现出良好的性能表现和实用价值。未来结合自动加样器与高通量分析软件，可进一步提升实验效率与数据解读深度。