1. 校准的意义与原理

1.1 校准的意义

• 数据准确性：消除光源、探测器、光路变化带来的系统性误差。

• 设备稳定性：通过检测并调整系统参数，保持长期稳定运行。

• 法规合规：在GLP/GMP、ISO等体系中，校准是定期必须进行的质量控制措施。

• 跨批次可比性：保证不同时间、不同批次实验结果的可比性。

1.2 校准的原理

Varioskan Flash的多模式检测依赖光学系统和电子信号处理系统。校准通过使用标准物质（已知光学特性）或内置参考模块，将实际测量值与标准值比较，计算偏差并调整系统参数，使测量结果接近真实值。

2. 校准类型

根据检测模式和维护需求，Varioskan Flash的校准可分为以下几类：

2.1 波长校准

• 目的：确保单色器输出的实际波长与设定波长一致。

• 方法：使用波长校准滤光片或标准吸收体（如Holmium氧化物滤片），其在特定波长有已知吸收峰，检测这些峰位置来调整波长设定。

2.2 吸光度校准

• 目的：保证吸光度读数与标准值一致。

• 方法：使用已知吸光度值的标准滤片或溶液（如NIST标准溶液），在多个波长下测量并调整吸光度计算系数。

2.3 荧光灵敏度校准

• 目的：保证荧光检测的灵敏度与信号强度在标准范围。

• 方法：使用标准荧光溶液（如Quinine sulfate、Rhodamine B等）在指定激发/发射波长下测量，调整PMT增益与信号线性范围。

2.4 发光检测校准

• 目的：确保化学发光模式下信号强度与参考值一致。

• 方法：使用已知发光强度的标准光源或发光参考液，检测并调整系统响应。

2.5 光程校正

• 目的：补偿不同孔位液面高度差异带来的吸光度差异。

• 方法：使用标准板测定光程差异，系统自动计算补偿系数。

3. 校准所需工具与材料

• 原厂校准套件：Thermo Scientific提供的Varioskan Flash专用校准板或滤光片。

• 标准溶液：

• 吸光度校准：NIST认证的中性密封液或钴盐溶液。

• 荧光校准：Quinine sulfate、Fluorescein等标准溶液。

• 发光校准：稳定发光参考液。

• 比色皿或标准孔板：用于盛放校准溶液，保证光程一致。

• 洁净工具：无尘布、去离子水、移液器等。

4. 校准前准备

1. 仪器预热
   开机预热至少30分钟，使光源和电子系统达到稳定状态。

2. 环境条件
   保持室温稳定（20–25°C）、湿度适中，避免强光、灰尘、振动。

3. 样品准备
   按厂家说明准备或稀释标准溶液，避免气泡和杂质。

4. 软件准备
   打开SkanIt软件，进入“仪器维护”或“校准”模块。

5. 校准操作步骤

5.1 波长校准

1. 将波长校准滤光片或标准吸收板放入样品仓。

2. 在SkanIt软件中选择波长校准程序。

3. 仪器会扫描指定波长范围（如200–800 nm），检测峰位。

4. 软件与标准峰位比较，自动调整单色器设定。

5.2 吸光度校准

1. 将已知吸光度的标准滤片或溶液放入孔板或比色皿。

2. 在指定波长（如230 nm、260 nm、340 nm、600 nm等）进行测量。

3. 软件计算实际读数与标准值的差异，调整吸光度转换系数。

4. 保存校准数据。

5.3 荧光灵敏度校准

1. 将标准荧光溶液加入孔板或比色皿。

2. 设定激发/发射波长（如Fluorescein：Ex 485 nm/Em 520 nm）。

3. 读取信号，调整PMT增益或灵敏度系数。

4. 确认信号在标准范围内。

5.4 发光模式校准

1. 准备稳定的发光标准液。

2. 在黑暗条件下进行测量。

3. 系统比较实际值与标准值，调整响应参数。

5.5 光程校正

1. 在每个孔中加入固定体积的标准溶液。

2. 测量吸光度并计算光程差异。

3. 系统自动保存光程补偿系数，用于后续实验。

6. 校准周期与记录

6.1 建议周期

• 波长校准：每6–12个月。

• 吸光度校准：每3–6个月或高强度使用后。

• 荧光与发光校准：每3–6个月，或更换光源后。

• 光程校正：每次更换孔板类型或检测异常时。

6.2 校准记录

• 保存校准报告，包括日期、操作者、校准标准、结果、偏差值。

• 建议打印并存档，或保存在实验室管理系统中。

7. 注意事项

1. 使用厂家推荐的校准耗材，避免不匹配导致的偏差。

2. 校准溶液需在有效期内，并在恒温条件下使用。

3. 避免溶液溢出污染光学组件。

4. 校准过程尽量减少环境光干扰。

5. 校准完成后应立即进行一次实验测试，验证校准效果。

8. 常见问题与解决

8.1 校准失败

• 原因：标准材料污染或失效、光路受阻、软件设置错误。

• 解决：更换标准物质、清洁光路、检查程序设置。

8.2 校准后读数仍偏差

• 原因：环境温度波动、样品质量问题、光源老化。

• 解决：稳定环境、检查样品、考虑更换光源。

8.3 多模式间精度不一致

• 原因：不同模式校准周期不一致。

• 解决：统一安排多模式的校准计划。

9. 优化建议

1. 将校准纳入实验室SOP，并指定专人负责。

2. 在LIMS系统中建立校准提醒与记录功能。

3. 对高精度实验（如药物IC50测定）可在实验前进行快速校准。

4. 定期对比不同仪器的测量结果，验证校准一致性。

10. 总结

Varioskan Flash的多模式检测优势只有在长期稳定、精确的校准支持下才能充分发挥。通过定期进行波长、吸光度、荧光灵敏度、发光模式以及光程的校准，并结合完善的记录与质量管理，可以显著提升实验数据的准确性和可重复性。
科学合理的校准计划不仅是保证科研成果可信度的关键，也是满足实验室质量体系和法规要求的重要保障。