一、Varioskan Flash 光谱扫描概述

Varioskan Flash 是 Thermo Scientific 出品的一款多模式多功能微孔板读数仪，支持吸光度、荧光强度、时间分辨荧光、化学发光等多种检测方式，其中**光谱扫描（Spectral Scanning）**功能是其重要特色之一。

光谱扫描指在一定波长范围内以设定的波长间隔逐点测量样品的光学信号，得到完整的光谱曲线。该功能能够全面反映样品在紫外—可见—近红外波段的吸收或发射特性，为波长选择、反应机理研究及多组分分析提供重要依据。

Varioskan Flash 配备全光谱单色仪，可在 200–1000 nm 范围内任意设定扫描波长，并且在吸光度、荧光、化学发光等不同模式下均可执行光谱扫描。

二、光谱扫描原理

光谱扫描依赖于以下核心原理：

1. 单色光产生

• 仪器内部的全息光栅单色仪通过旋转调节，将光源发出的宽谱光分解成不同波长的单色光。

• 通过光学系统选择目标波长照射到样品。

2. 信号采集

• 样品吸收或发射光信号后，由高灵敏探测器（光电二极管或光电倍增管）接收并转化为电信号。

• 在荧光模式下，激发光与发射光通过滤光或单色仪分离，确保检测的信号纯净。

3. 波长步进与扫描

• 单色仪按照设定步长（如 1 nm、2 nm 等）逐步改变波长，在整个扫描范围内逐点测量信号强度。

• 最终绘制出光谱曲线（波长—信号强度）。

三、光谱扫描的系统构成

1. 光源系统

• 氙灯：高强度、宽光谱输出，覆盖紫外到近红外区域，适合吸光度和荧光激发。

• 卤素灯（部分型号）：主要用于可见—近红外区域，输出稳定性好。

2. 单色仪光学系统

• 全息光栅结构，波长可连续可调。

• 光谱带宽窄（通常 < 5 nm），保证扫描精度。

3. 光路与滤光组件

• 光路自动切换吸收、荧光、发光模式。

• 荧光模式下配备二次单色仪或滤光片分离激发光与发射光。

4. 探测器

• 光电二极管（吸光度检测）。

• 光电倍增管（荧光检测），具备高灵敏度和低噪音特性。

5. 控制与数据处理系统

• 内部处理器控制波长切换与信号采集。

• SkanIt 软件执行数据记录、曲线绘制和分析。

四、光谱扫描的参数设置

在 Varioskan Flash 上进行光谱扫描前，需要在软件中进行以下设置：

1. 扫描模式选择

• 吸光度光谱扫描。

• 荧光激发光谱扫描。

• 荧光发射光谱扫描。

2. 波长范围

• 起始波长与终止波长（例如 240–800 nm）。

• 范围应覆盖目标分子的吸收或发射区间。

3. 波长步长

• 常用 1 nm 步进，精度高，适合精细分析。

• 若扫描范围很宽且信号变化平缓，可用 2–5 nm 步长以加快速度。

4. 读取速度与积分时间

• 高灵敏检测（弱信号）时应增加积分时间（如 100–200 ms）。

• 强信号或粗略扫描可使用较短积分时间。

5. 样品类型与孔板设置

• 选择 96 孔、384 孔或比色皿模式。

• 在软件中设定样品布局（空白孔、样品孔）。

五、光谱扫描操作流程

1. 启动与预热

• 按启动规程开启 Varioskan Flash，并等待光源预热稳定（氙灯约需 5 分钟）。

2. 打开 SkanIt 软件

• 确认仪器已连接并被识别。

• 进入新实验方法创建界面。

3. 设定扫描参数

• 选择检测模式（吸光度/荧光）。

• 输入扫描范围与步长。

• 设定积分时间与读取速度。

4. 装载样品

• 微孔板或比色皿需干净无划痕。

• 样品体积足够覆盖光路（一般 ≥100 μL 对于 96 孔板）。

5. 执行扫描

• 点击“开始”执行扫描，仪器将按设定波长依次读取数据。

• 软件实时显示扫描进度与信号曲线。

6. 保存与分析数据

• 扫描结束后，保存原始数据和曲线图。

• 可进行峰值分析、曲线平滑、背景扣除等处理。

六、光谱扫描的典型应用

1. 未知样品吸收峰分析

• 通过全谱扫描找到最大吸收峰，便于选择最佳检测波长。

2. 荧光染料特性测定

• 激发光谱与发射光谱的获取，有助于优化激发/发射组合。

3. 酶反应动力学研究

• 在反应过程中扫描，观察产物生成过程中的光谱变化。

4. 蛋白质与核酸纯度检测

• 260–280 nm 扫描可分析样品纯度。

5. 多组分分析

• 利用不同组分在不同波长的特征峰进行定量分离。

七、数据分析方法

1. 峰值识别

• 确定主峰位置和半峰宽，作为后续检测的参考波长。

2. 峰面积计算

• 对于发射光谱，可计算峰面积作为相对量化指标。

3. 光谱比值法

• 通过两个波长的吸光度或荧光强度比值分析混合物比例。

4. 背景扣除

• 使用空白样品光谱作为背景进行扣除，提高信噪比。

八、常见问题与排查

1. 信号过低

• 检查样品浓度和体积。

• 增加积分时间或降低步长。

• 确认光源状态正常。

2. 信号饱和

• 稀释样品或缩短积分时间。

• 对荧光模式可降低光源强度。

3. 光谱噪音大

• 检查光路清洁度。

• 确保环境无强光干扰。

• 稳定实验室温度，避免热噪音增加。

4. 光谱漂移

• 检查单色仪校准状态。

• 使用标准物质进行波长验证。

九、性能维护要点

• 定期清洁光学窗口和托盘区域，防止灰尘影响信号。

• 每 6–12 个月检查光源寿命，及时更换。

• 每年进行波长与光度校准，确保扫描数据的准确性。

• 运行软件自检功能，发现异常及时记录并处理。

十、总结

Varioskan Flash 的光谱扫描功能为样品的光学特性分析提供了极高的灵活性和精度，特别适合未知波长选择、荧光染料特性测定、多组分分析等复杂任务。通过合理设定扫描参数、规范操作流程并结合数据分析方法，可以获得准确、可靠且信息量丰富的光谱数据。同时，保持设备光学系统清洁和光源稳定，是确保光谱扫描性能的关键。