Thermo Scientific Multiskan Ascent 酶标仪校准方法详解

一、前言

Thermo Scientific Multiskan Ascent 是一款高精度滤光片式酶标仪，广泛应用于ELISA、蛋白定量、细胞学实验、酶动力学分析等场景中。为了保证测定结果的准确性和可重复性，必须对设备进行定期校准与性能验证。

本文将系统介绍 Multiskan Ascent 酶标仪的校准方法，包括吸光度校准、波长校验、重复性与线性验证、滤光片检查与光源维护等内容，帮助用户在实际操作中建立标准化的仪器质量控制流程。

二、校准的必要性与校准周期建议

2.1 为什么需要校准

• 保证准确性：校准后数据与标准值一致，确保实验可信。

• 提高重复性：减少批间、日间误差，提升数据稳定性。

• 符合规范：满足GLP、GMP、ISO17025等实验室管理标准。

• 避免误差积累：光源老化、滤光片污染、光学路径偏移等都会导致检测误差。

2.2 校准周期建议

如设备用于临床或法规要求严格的实验，建议按月度执行完整校准流程并记录。

三、Multiskan Ascent 校准准备工作

3.1 工具与耗材准备

• NIST溯源标准滤光片 或商业吸光度校准板（如 Starna、Thermo 原厂套件）；

• 空白标准微孔板（聚苯乙烯材质）；

• 去离子水或PBS缓冲液（用于参考孔）；

• 0.1%、0.2%、0.4%、1.0%、2.0% 硫酸钴或铬酸盐标准溶液（用于液体吸光度校准）；

• 吸头、微量移液器；

• 清洁用品（无尘布、酒精）；

• Thermo Ascent 软件及校准协议模板。

3.2 仪器状态检查

在开始校准前，请确认：

• 酶标仪光源运行正常；

• 滤光片轮旋转顺畅、位置准确；

• 光学舱无积尘或污染；

• 软件可正常通讯并能执行测试协议；

• 上一次校准记录已归档。

四、吸光度校准方法（OD准确性）

4.1 固体标准滤光片法

步骤如下：

1. 将已知吸光度值（如0.2、1.0、2.0）标准滤光片依次放入微孔板；

2. 在 Ascent 软件中创建“吸光度校准”协议；

3. 设定波长（如450 nm）；

4. 执行读取，记录系统读值；

5. 将读数与标称值比较，误差应≤±0.010 OD；

6. 若误差超限，需检查光源、滤光片状态或执行软件校正。

4.2 液体标准溶液法

1. 使用已知浓度的硫酸钴或铬酸盐溶液配置系列标准；

2. 在微孔板中加样，每组3孔重复；

3. 空白孔加PBS或纯水；

4. 读取各孔OD值；

5. 计算平均值与标准偏差，与理论OD对比；

6. 用线性回归拟合，R²应≥0.99。

五、波长验证方法（波段准确性）

波长准确性校验确保滤光片所选波长能准确对应样本吸收峰位置。

方法一：已知吸收峰染料扫描法

1. 准备一组染料溶液，如：

• 硝基苯酚（吸收峰在400–420 nm）；

• 偶氮染料（吸收峰在540–600 nm）；

2. 设定波长扫描（需多波长读数功能）；

3. 获取样品在不同波长下的OD值；

4. 确定最大吸收波长是否与理论值一致；

5. 偏差应不超过±5 nm。

方法二：波长校准滤光片（稀土玻璃）

使用专用光谱滤光片，如钬玻璃（Holmium Oxide）或Didymium滤光片，其在不同波长有固定吸收峰。比对酶标仪检测峰位与理论值。

六、重复性与线性验证

6.1 孔内重复性

1. 将浓度一致的标准溶液加入至少12个孔；

2. 读取OD值，计算标准差与CV值；

3. CV应小于2%为优，≤5%可接受。

6.2 OD线性验证

1. 使用不同浓度标准溶液，涵盖0–3.0 OD范围；

2. 读取每组OD；

3. 用标准曲线拟合数据，计算线性回归R²；

4. 要求R² ≥ 0.990，残差≤±0.015 OD。

七、滤光片与光源校验

7.1 滤光片透光率测试

• 检查是否因老化、污染或刮伤导致波段漂移；

• 使用原厂检测滤光片比对透光值或使用光谱仪测试；

• 若透光率下降超过10%，应更换滤光片。

7.2 光源检测与更换建议

• 每次校准前进行光源亮度自检；

• 光源使用寿命一般为1000–2000小时；

• 若读取时间变长或OD值漂移增大，应更换卤素灯。

八、软件校正流程（使用 Ascent 软件）

Multiskan Ascent 软件不具备强制内置校准工具，但可通过以下方式实现校准支持：

1. 创建 “Calibration Protocol” 模板，命名为“OD_Cal_450”；

2. 设定读取波长、空白、标准位置；

3. 执行数据采集后，保存为独立文件；

4. 在Excel中对比标准值与读取值；

5. 若存在系统性误差，可通过软件“偏移校正”功能输入修正系数；

6. 将修正结果用于后续样本测定。

九、校准记录与文档要求（符合GMP/GLP）

为满足法规审计与质量管理体系的要求，校准过程应全程记录并归档。

9.1 校准文档应包括：

• 校准日期、人员签名；

• 使用的标准品批号与证书编号；

• 仪器编号、软件版本；

• 校准数据原始记录；

• 偏差分析与处理结果；

• 判断结论（通过/不通过）；

• 后续处置（如需维修或重新校准）。

9.2 数据保存建议

• 纸质校准报告存档不少于5年；

• 电子数据应双重备份，建议同步上传至LIMS或实验云系统；

• 对于关键信息，应设置“只读”权限并设有审计追踪功能。

十、校准失败的应对策略

十一、结语与建议

Multiskan Ascent 酶标仪的稳定性和精度对实验数据质量至关重要。建立科学、周期性的校准体系，不仅是设备管理的基本要求，更是科研、诊断、药品分析等高标准实验环境中的必备规范。

建议实验室根据本指南，结合本单位设备使用频率、检测项目重要性及质量体系要求，建立涵盖吸光度、波长、重复性、光学组件等维度的综合校准计划，并配套完整的文档记录与责任人制度，确保设备始终运行在最优状态。