赛默飞酶标仪 Varioskan Flash 波长范围详解

一、设备概述

Varioskan Flash 是赛默飞（Thermo Scientific）推出的高端多模式光学检测平台，具备吸光度（Absorbance）、荧光（Fluorescence）、时间分辨荧光（Time-Resolved Fluorescence）、荧光偏振（Fluorescence Polarization）、发光（Luminescence）等多种检测能力。
与传统依赖固定滤光片的酶标仪不同，Varioskan Flash 使用 单色仪（Monochromator） 技术，可以在宽波长范围内自由选择激发与检测波长，覆盖从紫外到近红外的多种光谱区域。这种设计极大提高了实验的灵活性与方法开发能力。

波长范围是光学检测设备的核心参数之一，它直接决定了能否适配不同类型的分子检测、底物反应以及光谱分析任务。掌握 Varioskan Flash 的波长范围与性能特点，有助于科学设计实验方案和优化检测灵敏度。

二、波长范围的定义与意义

波长范围 指仪器可以选择的光波的最短和最长波长区间。
对于多模式酶标仪而言，波长范围不仅决定了能否覆盖某一化合物的吸收峰或发射峰，还影响到信噪比、灵敏度、背景干扰水平等指标。

在光学检测中，不同波长对应不同能量的光子：

• 短波长（紫外区 200–400 nm）光子能量高，适合检测核酸、蛋白等分子吸收。

• 中波长（可见光区 400–700 nm）广泛用于比色反应和多数荧光染料的检测。

• 长波长（近红外区 700–1000 nm）适合低背景检测、深部组织成像以及某些特定染料的发射波长采集。

对于多模式检测平台而言，波长范围越宽，应用覆盖面越广，尤其在需要多波长扫描、未知峰值寻找、或者多标记实验时更具优势。

三、Varioskan Flash 光学系统与波长能力

1. 光源

• 吸光度模式：氙闪光灯（200–1000 nm 连续光谱输出）

• 荧光模式：同样使用氙灯作为激发光源，结合单色仪选择所需波长

• 发光模式：无需外部激发光源，由样品自发光

氙闪光灯寿命长、光强稳定，光谱分布均匀，尤其在紫外区和近红外区的能量输出高于卤素灯，更适合宽波长应用。

2. 单色仪技术

• 激发与检测端均使用双单色仪，可独立设定激发波长和检测波长

• 波长选择精度高（步进 1 nm）

• 波长精度：± 2 nm

• 波长重复性：± 0.2 nm

双单色仪配置使 Varioskan Flash 在荧光检测中可以有效隔离激发光和发射光，减少串扰，提升灵敏度。

3. 波长范围

• 吸光度模式：200–1000 nm

• 荧光模式（激发与发射）：200–1000 nm

• 时间分辨荧光模式：激发与发射波长范围同上，但检测窗口延迟可调

• 发光模式：通常无需选择波长，可配合发射光谱扫描分析（200–1000 nm）

四、各检测模式的波长应用

1. 吸光度（Absorbance）

• 波长范围：200–1000 nm

• 典型应用

• A260/A280 核酸纯度检测（260 nm、280 nm）

• 蛋白质比色定量（595 nm Bradford，562 nm BCA）

• ELISA 检测（常用 450 nm、630 nm）

• 酶动力学（340 nm NADH 测定）

吸光度模式支持单波长、双波长（主波长+参考波长）以及全光谱扫描模式，可用于寻找未知吸收峰或分析反应过程中的光谱变化。

2. 荧光强度（Fluorescence Intensity）

• 激发波长范围：200–1000 nm

• 发射波长范围：200–1000 nm

• 典型应用

• FITC 检测（Ex 488 nm / Em 520 nm）

• Cy5 检测（Ex 649 nm / Em 670 nm）

• 钙离子探针 Fluo-4（Ex 494 nm / Em 516 nm）

• NADH 自发荧光（Ex 340 nm / Em 460 nm）

宽波长范围允许检测从紫外到近红外的多种荧光探针，并支持激发、发射光谱扫描以优化实验参数。

3. 时间分辨荧光（Time-Resolved Fluorescence, TRF）

• 波长范围：激发 200–1000 nm，发射 200–1000 nm

• 特点：在激发光结束后的延迟时间窗口采集信号，去除短寿命背景

• 典型应用

• 铕标记免疫分析（Ex 340 nm / Em 615 nm）

• 铽配合物检测（Ex 340 nm / Em 545 nm）

TRF 模式在选择波长时，激发端一般固定在稀土离子配体的吸收峰，发射端选择其特征长寿命峰值。

4. 荧光偏振（Fluorescence Polarization, FP）

• 波长范围：与荧光模式相同

• 应用：基于分子旋转速度变化的结合实验（Ex/Em 波长根据荧光标记分子决定）

• 例如 FAM 标记分子可选 Ex 485 nm / Em 520 nm

5. 发光（Luminescence）

• 无需激发波长，但可进行发射光谱扫描（200–1000 nm）

• 典型应用：

• 荧光素酶（发射峰约 560 nm）

• NanoLuc（发射峰约 460 nm）

• ATP 化学发光分析（波长取决于底物类型）

五、波长选择与优化策略

1. 查找化合物光谱特性

• 在文献或光谱数据库中查询待测化合物的吸收峰或发射峰

• 若未知，可利用全光谱扫描（1–2 nm 步长）获取峰值

2. 优化激发/发射组合

• 激发波长选择峰值或稍低于峰值位置以减少背景光

• 发射波长选择峰值，并避开激发光波段

3. 双波长吸光度测定

• 主波长测量信号，参考波长扣除背景（如 ELISA 的 450/630 nm 组合）

4. 宽波长覆盖多标记实验

• 多色荧光检测中，通过单色仪快速切换激发/发射波长实现多通道检测

六、应用案例

案例 1：核酸纯度检测

• 波长选择：260 nm（核酸吸收峰）和 280 nm（蛋白吸收峰）

• 计算 A260/A280 比值判断样品纯度

案例 2：蛋白质定量（BCA 法）

• 波长选择：562 nm

• 全光谱扫描可验证峰值位置是否与标准一致

案例 3：多色荧光检测

• 样品含有 FITC（Ex 488 / Em 520）与 Cy5（Ex 649 / Em 670）

• 仪器可在两组波长间快速切换，采集多色数据

案例 4：时间分辨荧光免疫分析

• 使用铕标记探针，激发 340 nm，延迟检测发射 615 nm

• 有效去除血清自发荧光

七、注意事项

1. 波长精度验证

• 定期使用标准吸收滤光片验证波长准确性

2. 光源性能维护

• 氙灯老化会影响波长能量分布，需按使用时长更换

3. 避免波长设置过近

• 荧光激发与发射波长应间隔足够，以减少信号串扰

4. 容器选择与波长匹配

• 紫外检测需使用石英比色皿或 UV 透过板

• 近红外检测需选择低背景塑料或专用光学材料

八、总结

Varioskan Flash 的 200–1000 nm 全波段覆盖能力，使其在从紫外核酸检测到近红外荧光应用的全谱领域均能胜任。
借助双单色仪结构，用户可以自由选择和组合激发与发射波长，进行高灵敏度、高特异性的光学检测。合理利用波长范围，不仅能提升信噪比和检测限，还能拓展仪器的应用边界，为多模式检测提供灵活的解决方案。