赛默飞酶标仪 Multiskan Ascent 操作原理

一、设备概述

赛默飞（Thermo Scientific）Multiskan Ascent 是一款自动化微孔板光学检测设备，主要用于酶联免疫吸附试验（ELISA）、蛋白定量、酶动力学研究、细胞活性分析等实验。它基于光吸收检测原理，将光源发出的宽谱光经滤光系统筛选为特定波长的单色光，再穿过含有反应液的微孔板，测量透射光强度，并通过比尔–朗伯定律计算样品吸光度。
其核心功能是为研究人员提供快速、稳定且高精度的光学测量能力，实现从单波长到双波长、从终点法到动力学监测的多模式检测。

二、光学检测原理

1. 基础原理：比尔–朗伯定律

酶标仪测量吸光度的理论基础是比尔–朗伯定律（Beer–Lambert Law）：

$$A=\epsilon \cdot c\cdot l$$

其中：

• $A$ 为吸光度（无单位）；

• $\epsilon$ 为摩尔吸光系数（L·mol⁻¹·cm⁻¹）；

• $c$ 为溶液中吸收物质的浓度（mol·L⁻¹）；

• $l$ 为光程长度（cm）。

在微孔板检测中，光程长度主要由孔内液体高度决定，通常固定不变。因此，在特定波长下，吸光度与浓度呈线性关系。

2. 光吸收与颜色变化

在 ELISA 等检测中，底物与酶反应生成有色产物，不同浓度的产物对特定波长光的吸收程度不同。酶标仪通过测量透射光强度变化，反推出产物浓度。

三、光路结构

Multiskan Ascent 的光路系统由以下部分组成：

1. 光源单元

• 使用稳定的卤素钨灯或氙灯，发出连续光谱。

• 光源亮度稳定性直接影响检测精度。

2. 准直与聚光系统

• 透镜和光纤用于将光线准直并聚焦到微孔板孔底。

3. 滤光系统

• 采用带通干涉滤光片，选择特定波长范围的光。

• 滤光片安装在可旋转的滤光片轮上，实现快速切换波长。

4. 样品承载平台

• 微孔板自动进板到光路下方，逐孔检测。

• 高精度机械定位保证光束正中通过液柱中心。

5. 光电探测器

• 常用硅光二极管（Si-PD），将透射光强转化为电信号。

四、滤光与波长选择机制

1. 滤光片作用

• 仅允许接近中心波长的窄带光通过。

• 典型带宽为 8–10 nm，保证单色性。

2. 波长切换

• 滤光片轮由步进电机驱动，按软件指令旋转到目标波长位置。

• 波长切换速度快，可满足双波长检测需求。

3. 波长选择对实验的意义

• ELISA TMB 显色终点常选 450 nm。

• 磷酸酶底物反应常选 405 nm。

• 参考波长 620 nm 用于校正背景干扰。

五、信号采集与处理

1. 光电转换

透射光到达探测器后，光子被转换为与光强成比例的电流信号。

2. 信号放大与滤波

弱小的电流信号经过低噪声放大电路放大，同时通过滤波器去除干扰噪声。

3. 模数转换（ADC）

放大后的模拟信号送入高分辨率 ADC 转换为数字信号。

4. 数据计算

• 仪器计算透过率 T=I/I0T = I / I_0T=I/I0（其中 I0I_0I0 为空白孔信号，$I$ 为样品孔信号）。

• 根据公式 A=−log⁡10TA = -\log_{10} TA=−log10T 得到吸光度值。

六、检测模式

1. 单波长检测

• 测量一个波长下的吸光度。

• 适合单一吸收峰的终点测定。

2. 双波长检测

• 同时或依次测量主波长与参考波长吸光度。

• 差值计算可消除背景噪声和微孔板缺陷的影响。

3. 动态检测

• 在设定时间间隔内连续测量吸光度变化。

• 可计算反应速率、动力学常数。

七、软件与数据计算

1. 参数设定

• 选择波长、检测模式、测量时间间隔等。

2. 背景扣除与参考修正

• 自动扣除空白孔吸光度。

• 双波长模式下自动计算差值。

3. 标准曲线与结果换算

• 支持线性、二次、4PL、5PL 等拟合方式。

• 根据标准曲线自动计算未知样品浓度。

4. 数据存储与导出

• 保存为多种格式，便于后续统计与分析。

八、影响精度的因素

1. 光源稳定性

2. 滤光片老化或污染

3. 微孔板材质与透明度

4. 样品体积与光程一致性

5. 温度波动对反应速率的影响

6. 机械定位精度

九、应用场景中的原理体现

1. ELISA

• 酶与底物反应生成有色产物，通过主波长测量其浓度。

• 双波长检测可减小浑浊度干扰。

2. 蛋白定量（Bradford、BCA）

• 染料与蛋白结合产生特定波长的吸收峰。

• 吸光度与蛋白浓度呈比例关系。

3. 酶动力学

• 持续监测吸光度变化速率，计算酶活性。

4. 细胞活性检测（MTT、WST-1）

• 代谢产物显色强度反映细胞活力。

十、原理保障与维护

1. 定期校准波长与吸光度精度

2. 保持光学系统清洁

3. 更换老化的光源与滤光片

4. 保持机械系统润滑与定位精度

5. 在软件端进行周期性性能验证

十一、总结

Multiskan Ascent 的操作原理核心在于利用光学吸收法检测样品的光学特性变化，通过精密的光路设计、波长控制、光电转换与数据处理，实现对微孔板中样品的高精度、快速检测。理解其工作机制不仅有助于正确使用和优化实验参数，也为维护与故障排查提供了科学依据。