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一、概述

伯乐（Bio-Rad）Gene Pulser Xcell 电穿孔仪是一种高精度、可控性强的基因导入设备，广泛应用于分子生物学、细胞工程及生物制药等研究领域。其核心技术是利用短时高电场脉冲在细胞膜上形成可逆性纳米孔，使外源核酸、蛋白质或其他带电分子穿透细胞膜进入胞质或细胞核。

在整个电穿孔实验中，样品制备是决定实验成功率的关键环节。合理的细胞处理、缓冲体系选择、外源物质纯度控制以及温度与离子浓度的调节，均直接影响电穿孔效率和细胞存活率。

本文将系统介绍Gene Pulser Xcell 电穿孔仪在不同实验体系中的样品制备方法与参数要求，涵盖细菌、酵母、哺乳动物细胞及植物原生质体等典型样本类型，为研究者提供标准化的前处理方案与操作指导。

二、电穿孔样品制备的基本原则

1. 样品纯净：样品中不得含有盐分、蛋白杂质或颗粒物，否则容易引发电弧放电，损伤细胞及设备。

2. 细胞状态良好：处于生长旺盛期的健康细胞对电穿孔反应最佳。衰老或死亡细胞膜稳定性差，易破裂。

3. 低离子强度缓冲液：选择低电导率的电穿孔缓冲体系以减少电解效应。

4. 温度控制：操作过程中维持低温（4°C）可降低热积累，提高细胞生存率。

5. 样品体积与浓度适中：保证电极间液体充满但不过量，防止气泡生成。

这些原则适用于所有类型的电穿孔实验，是确保数据可重复性与结果稳定性的基础。

三、细菌样品制备

1. 细菌培养与收集

• 选取新鲜菌株，接种于液体LB培养基中，37°C摇床培养至对数生长期（OD600≈0.5–0.7）。

• 过度培养会导致细胞壁增厚、通透性降低，影响穿孔效率。

2. 洗涤步骤

• 将菌液以4°C、5000 rpm离心5分钟，弃上清。

• 用无离子灭菌水或低离子缓冲液（如10%甘油溶液）洗涤3–4次。

• 每次洗涤后轻轻重悬，直至电导率降至10 µS/cm以下。

3. 悬浮与浓缩

• 最后一次离心后将细胞重悬于10%甘油溶液中，浓度约为10⁹ cells/mL。

• 样品可直接用于电穿孔，或在–80°C短期保存。

4. 质粒DNA准备

• 使用高纯度质粒（A260/A280比值1.8–2.0），浓度建议为10 ng/µL。

• 溶液应无盐、无乙醇残留，否则会导致电弧。

5. 混合与电穿孔前处理

• 在无菌冰上混合细胞与DNA溶液，典型体积比例为：

• 细胞：50 µL

• DNA溶液：1–2 µL

• 混合后立即装入0.1 cm电极杯中进行电击。

此法适用于大肠杆菌、沙门氏菌等常见原核模型。

四、酵母样品制备

1. 细胞培养

• 选择活性强的酵母菌株，接种于YPD培养基中30°C培养至中期（OD600≈0.8）。

• 细胞壁较厚的酵母需进行软化预处理。

2. 酶解与洗涤

• 使用1 M山梨醇溶液作为渗透保护剂。

• 可加入少量β-葡聚糖酶或Zymolyase轻度酶解以提高膜通透性。

• 离心（3000 rpm，5分钟）后用冰冷山梨醇缓冲液洗涤3次。

3. 悬浮液制备

• 将细胞重悬于1 M山梨醇缓冲液中，浓度为1–2 × 10⁸ cells/mL。

• 若样品过稠，可适当稀释。

4. 外源DNA加入

• DNA纯度需高于90%，量约为2–5 µg。

• 混合后轻轻吹匀，避免剧烈振荡造成细胞破裂。

5. 电穿孔前准备

• 样品温度应保持在冰上4°C；

• 确保电极杯干燥，无气泡；

• 使用0.2 cm或0.4 cm电极杯，根据实验设计选择电压（一般250–500 V）。

五、哺乳动物细胞样品制备

1. 细胞选择与培养

• 常用细胞系包括HeLa、CHO、293T、Jurkat等。

• 细胞应处于对数生长期，无污染，活性≥95%。

2. 收集与洗涤

• 贴壁细胞需用0.25%胰酶消化后离心收集。

• 悬浮细胞直接离心（1000 rpm，5分钟）。

• 使用无钙无镁PBS或专用电穿孔缓冲液洗涤两次，以去除培养基盐分。

3. 电穿孔缓冲液组成

• 典型组成：

• 10 mM HEPES（pH 7.2）

• 250 mM 蔗糖

• 1 mM MgCl₂

• 0.1 mM CaCl₂

该体系电导率低，可有效减少电解反应。

4. 细胞浓度与外源物质

• 调整细胞浓度为2×10⁶–1×10⁷ cells/mL。

• 加入高纯度质粒DNA（10–20 µg/mL）或mRNA（1–5 µg/mL）。

• 对蛋白质或复合体导入，可适当降低浓度以减轻负荷。

5. 装样与操作

• 将300 µL样品转入0.4 cm电极杯，轻轻拍打去除气泡。

• 使用方波模式（250 V、10 ms×2次）效果最佳。

• 电击后立即加入1 mL预温培养基中，37°C孵育1小时进行修复。

六、植物原生质体样品制备

1. 原生质体分离

• 取新鲜叶片或悬浮细胞，切成细条后置于酶解液（含纤维素酶与果胶酶）中。

• 25°C轻轻震荡3–5小时，直至形成悬浮单细胞。

• 通过滤网去除杂质，低速离心收集原生质体。

2. 洗涤与缓冲体系

• 用0.4 M甘露醇溶液洗涤3次以去除酶液残留。

• 重悬于含Ca²⁺的渗透缓冲液中（例如0.4 M甘露醇 + 10 mM CaCl₂ + 10 mM MES，pH 5.7）。

3. DNA或RNA加入

• 推荐使用高纯度质粒DNA 10–30 µg/mL。

• 混合后轻轻倒置数次，避免泡沫。

4. 装样与电击条件

• 电极杯间距0.4 cm，体积约300 µL。

• 设置200 V、30 ms方波单脉冲。

• 电击后立即转入恢复培养液中，25°C避光培养6–8小时。

七、RNA与蛋白质类样品制备

1. RNA样品

• 需使用RNase-free条件操作，所有溶液应经DEPC处理。

• RNA溶解于无盐缓冲液中（例如1 mM HEPES，pH 7.0）。

• 冷冻保存前避免反复冻融。

2. 蛋白质或复合体样品

• 蛋白应处于单体状态，避免聚集。

• 溶液pH应接近生理值（6.8–7.4）。

• 若含金属离子或盐分，应通过透析去除。

这些高分子物质进入细胞的难度较大，需在方波模式下延长脉冲时间或增加脉冲次数。

八、缓冲液的制备与质量控制

1. 常用缓冲液示例

所有缓冲液在使用前应经0.22 µm滤膜过滤灭菌，并在4°C保存不超过1周。

2. 电导率检测

• 理想电导率应低于50 µS/cm；

• 超过该值会导致电弧或加热现象。

3. pH与渗透压调节

• pH值应与细胞内环境相近，以减少电场刺激；

• 渗透压控制在250–400 mOsm/kg，防止细胞胀裂或脱水。

九、样品温度与储存

• 所有电穿孔操作应在低温条件下进行，避免高温导致电流不均或膜不可逆损伤；

• 样品制备后应立即使用；

• 若需暂存，可置于4°C短期保存（≤24小时），避免反复冻融。

十、装样注意事项

1. 确保电极杯干净、干燥，防止导电残留。

2. 样品体积适配电极间距，推荐：

• 0.1 cm杯：50–100 µL

• 0.2 cm杯：200 µL

• 0.4 cm杯：400 µL

3. 去除所有气泡，可轻轻敲击杯壁。

4. 装样后立即电击，避免长时间暴露。

十一、样品质量验证

在电穿孔前后均需检测样品质量：

• 显微镜观察：判断细胞完整性与形态。

• 台盼蓝染色：评估存活率。

• 电导率检测：确认缓冲液纯度。

• DNA/RNA浓度测定：保证导入剂量一致。

若细胞损伤严重，应重新调整缓冲体系或降低能量参数。

十二、特殊实验类型样品制备

1. CRISPR系统导入

• Cas9 mRNA 与 sgRNA 需在无离子环境下混合，比例1:1。

• 样品应预冷，避免RNA降解。

2. 免疫细胞转染

• T细胞、B细胞需在激活48小时后进行电穿孔。

• 使用专用低钠离子缓冲体系，保证细胞活性。

3. 高分子复合物导入

• 对蛋白-DNA复合体、脂质颗粒等样品，应调整电场至中等能量并延长脉冲。

十三、常见问题与处理

十四、样品制备的质量控制体系

1. 标准化操作：制定统一制备流程，减少人为误差。

2. 批次记录：详细记录细胞来源、缓冲液批号、DNA纯度。

3. 环境监控：保持无菌、低离子、低温条件。

4. 结果追踪：通过转染效率和细胞存活率评估制备质量。

十五、总结

在Gene Pulser Xcell电穿孔实验中，样品制备决定了实验的成败。
高质量的细胞、低电导率的缓冲体系、合理的温度控制和精确的体积操作，能显著提高转化效率并延长设备寿命。

科学的样品制备应具备三大特点：

• 标准化：操作规范、参数可重复；

• 精准化：浓度、电导率、温度控制在最佳范围；

• 兼容性：不同细胞类型对应差异化制备策略。

通过严格遵循样品制备原则，研究人员能够充分发挥伯乐Gene Pulser Xcell电穿孔仪的性能，实现稳定、高效、安全的电穿孔实验效果。