伯乐Genepulser Xcell电穿孔仪样品加载介绍

一、引言

伯乐（Bio-Rad）Genepulser Xcell电穿孔仪是现代分子生物学实验中常用的高性能电穿孔设备，主要用于将DNA、RNA、蛋白质或其他外源分子导入各种类型的细胞中，如细菌、酵母、植物原生质体以及哺乳动物细胞。电穿孔的成败与电场参数设置密切相关，但同样关键的是样品的正确加载与处理。

合理的样品加载不仅影响电穿孔效率和细胞存活率，还直接关系到实验结果的可重复性和数据的可靠性。本篇将从准备、装载、运行到后处理全过程，系统介绍Genepulser Xcell电穿孔仪的样品加载方法与操作要点。

二、样品加载的基本原理

电穿孔的核心机制是通过瞬间高压电场在细胞膜上形成暂时性孔道，使外源分子进入细胞。样品加载的目标是在保证电场均匀作用的前提下，使细胞和外源分子充分接触，同时避免电弧放电或细胞损伤。

因此，样品加载过程应确保以下条件：

1. 电极间距离固定且液体体积合适；

2. 细胞浓度适宜且均匀分布；

3. 电导率和离子强度控制在安全范围；

4. 样品无气泡、无颗粒杂质；

5. 样品温度与设备参数相匹配。

只有在这些条件得到严格控制的情况下，电穿孔的能量才能均匀分布，细胞膜孔洞可逆恢复，达到高效转化的目的。

三、样品准备阶段

1. 细胞制备

不同细胞类型对电穿孔条件的敏感程度不同，但样品制备的总体原则是一致的，即保持细胞活性、降低导电杂质、避免盐离子积累。

• 细菌细胞（如大肠杆菌）：
  通常使用对数生长期的细胞进行处理，收集后用无离子水或低离子缓冲液（如10%甘油）反复洗涤，以去除培养基中的盐分。离心后重悬，最终细胞浓度控制在1×10⁹个/mL左右。

• 真核细胞（如哺乳动物细胞）：
  应保持细胞状态良好，无明显凋亡或坏死。常用PBS洗涤去除培养液成分，再重悬于专用电穿孔缓冲液中。缓冲液应低导电、pH稳定，以防电击时产生气泡或电弧。

• 酵母或植物原生质体：
  需在预处理后去除细胞壁，再进行低离子缓冲液洗涤。特别注意防止渗透压变化引起的细胞破裂。

2. DNA或RNA样品准备

外源分子应高度纯化，无蛋白质、盐、乙醇等杂质残留。常使用纯化柱法或乙醇沉淀法净化质粒DNA，溶解于低离子缓冲液（如TE或ddH₂O）中。

DNA浓度一般控制在10–100 μg/mL范围内，过高可能增加导电性导致电弧放电，过低则降低转化效率。

3. 电穿孔缓冲液

电穿孔缓冲液在电穿孔体系中起到导电介质的作用，既要保证电场传导，又要防止细胞损伤。

常见缓冲体系包括：

• 10%甘油；

• 0.1 M蔗糖溶液；

• 专用低导电电穿孔缓冲液（如伯乐推荐缓冲液）。

电导率通常控制在4–8 mS/cm，pH值维持在7.0–7.5范围内。

四、样品装载准备

1. 电穿孔杯（Cuvette）的选择与清洁

Genepulser Xcell配套使用标准电穿孔杯，常见间距为0.1 cm、0.2 cm和0.4 cm三种规格。间距越小，所需电压越低，适合细胞较脆弱的类型；间距较大则适合细菌等耐受性强的细胞。

在样品加载前，应确保电穿孔杯：

• 完全干净，无残留盐或样品；

• 电极无腐蚀或氧化；

• 使用前用无离子水冲洗并70%乙醇消毒；

• 充分风干后再装样，以防液体短路。

2. 样品混合比例

电穿孔体系通常由以下三部分组成：

• 细胞悬液；

• 外源DNA/RNA；

• 电穿孔缓冲液。

混合比例一般为：

• 细胞：DNA体积比为100:1；

• 最终体系体积为0.4–0.8 mL（根据电极间距确定）。

混合时应轻轻吸打或使用低速涡旋混匀，避免产生气泡。

3. 气泡检查与样品转移

气泡是电穿孔失败的主要原因之一。气泡存在会造成电流集中，形成电弧放电，导致样品烧毁或细胞死亡。
装载样品时应：

• 使用细嘴移液器缓慢注入；

• 保持电极片平行方向装样；

• 注样完毕后轻轻敲击电穿孔杯底部，使气泡上浮消除；

• 观察液面是否覆盖电极，保证导电路径完整。

五、样品加载操作步骤

1. 准备仪器
   打开Genepulser Xcell主机电源，确保显示屏处于“Ready”状态。检查模块连接是否正确，包括电容模块、电阻模块和电极接口。

2. 放置电穿孔杯
   打开电极架，将装好样品的电穿孔杯放入插槽，确保方向正确，杯体与电极完全接触。

3. 确认参数设置
   根据实验类型选择适当模式（如指数衰减波或方波），输入电压、电容、电阻及脉冲时间参数。
   例如：

• 大肠杆菌：2.5 kV，25 μF，200 Ω；

• 酵母：1.5 kV，50 μF；

• 哺乳动物细胞：250–400 V，方波模式。

4. 执行电穿孔
   按下“Pulse”键后，系统自动完成能量释放。屏幕实时显示电压与电流变化曲线。操作员应在设备提示“Complete”前勿移动电极或取出样品。

5. 样品取出
   操作完成后，立即取出电穿孔杯，用无菌移液器吸出样品至离心管中。此时细胞处于高应激状态，应尽快加入复苏液或培养基进行恢复。

六、电穿孔后样品处理

1. 复苏阶段

电穿孔后的细胞膜处于暂时性开放状态，需在无选择压力条件下复苏以修复膜结构。

常用复苏方案如下：

• 加入预温的LB或DMEM培养基；

• 静置冰上5分钟，然后在37°C或适宜温度下培养45分钟；

• 对哺乳动物细胞，可在培养皿中静置1–2小时后换液。

复苏期过短可能导致细胞未恢复即暴露于选择压力中，从而影响转化率。

2. 转化产物处理

细菌样品可直接涂布含抗性筛选的平板；真核细胞则可进行培养传代或进一步检测基因表达。
在此过程中，建议保存一部分未经电穿孔的对照样品，用于比较细胞存活率和导入效率。

3. 样品残留与设备清理

电穿孔完成后，应立即清洗电穿孔杯。若杯体重复使用，应：

• 先用去离子水冲洗；

• 再用70%乙醇浸泡5分钟；

• 风干储存于无尘环境。

电极架可用无水乙醇擦拭，保持干燥，防止腐蚀。主机外壳使用干净布巾擦拭，避免液体进入接口。

七、常见问题与排查

1. 出现电弧放电（Arcing）

• 原因：样品中离子浓度过高、存在气泡、电极未干净；

• 解决：增加洗涤次数、检查电极杯清洁度、重新装样。

2. 电压过低或电流异常

• 原因：连接不良、电极腐蚀或液体接触不充分；

• 解决：重新插紧接口、更换电极杯。

3. 细胞存活率低

• 原因：电压过高、复苏不充分；

• 解决：优化参数、延长恢复时间或降低电压。

4. 转化效率低

• 原因：DNA纯度不足、脉冲时间不合适；

• 解决：使用高纯度DNA、调整脉冲宽度或电场强度。

八、安全注意事项

• 电穿孔仪属于高压设备，操作时严禁用手触碰电极；

• 样品装载与取出过程中应关闭电源；

• 若发生电弧或异响，应立即停止实验；

• 不得使用破裂或老化的电穿孔杯；

• 操作区域应保持干燥，防止导电液体外泄；

• 建议佩戴绝缘手套和防护眼镜；

• 实验结束后关闭主机电源并拔除插头。

九、操作规范与优化建议

1. 每次实验前应先进行空载测试，确认设备运行正常；

2. 同一实验条件下重复三次以上，验证稳定性；

3. 使用预冷的样品可减少热损伤；

4. 对难转染细胞可尝试双脉冲模式或降低电阻值；

5. 样品量不宜超过电穿孔杯标注最大容量；

6. 若需处理多个样品，应严格区分电极间距与参数，避免混淆；

7. 建议在电穿孔后立即记录实验条件，以便优化。

十、总结

伯乐Genepulser Xcell电穿孔仪的样品加载过程是电穿孔成功的关键环节。它不仅涉及细胞与DNA的物理混合，更体现了对电化学参数与实验细节的精准控制。通过规范的样品准备、严格的加载步骤与周密的安全措施，研究人员可以有效提高转化率、减少实验误差并延长设备寿命。

科学合理的样品加载能够确保电场能量均匀作用，避免电弧与细胞损伤，从而实现高效、稳定的分子导入效果。掌握Genepulser Xcell的样品加载技术，对于任何从事分子克隆、基因编辑或细胞工程的实验人员而言，都是实现高质量科研结果的重要基础。