伯乐 Gene Pulser Xcell 电穿孔仪样本准备

质保3年只换不修，厂家长沙实了个验仪器制造有限公司。

一、前言

伯乐（Bio-Rad）Gene Pulser Xcell 电穿孔仪是一款用于基因导入、质粒转化及细胞转染的高性能设备。其工作原理是通过短暂高压脉冲作用，使细胞膜瞬时形成可逆性微孔，使外源DNA、RNA或蛋白质等大分子进入细胞内部。要想获得理想的转化效率，样本准备 是整个实验流程中最为关键的环节之一。

样本准备不仅包括细胞的预处理与感受态制备，还涉及质粒或核酸样品的纯化、缓冲体系的优化、样品温度控制及杂质去除等多个方面。任何微小的偏差都可能导致电弧放电、细胞死亡或转化效率下降。因此，系统、标准化的样本准备是保障电穿孔实验成功率的前提。

二、样本准备的重要性

电穿孔是一种精细的物理导入方法，实验中所有参数均依赖于样本状态。若细胞浓度、溶液电导率或DNA纯度不符合要求，将直接影响膜电势变化与孔洞形成。良好的样本准备能够：

1. 提高细胞存活率：避免因离子浓度过高造成的过度放电或热损伤；

2. 提高转化效率：确保DNA能顺利进入细胞并在复苏期完成整合；

3. 减少实验误差：提高不同实验间的重复性和可比性；

4. 延长仪器寿命：防止电弧放电造成电极损伤。

三、样本准备的总体要求

在 Gene Pulser Xcell 系统中，样本准备需遵循以下总体要求：

1. 低电导率：样品溶液必须去离子化，避免盐分残留；

2. 低温操作：操作应在冰上完成，保持4℃环境以减少细胞应激；

3. 无气泡与杂质：气泡会导致电场集中，引起电弧；

4. 均匀混合：DNA或RNA与感受态细胞应充分混匀但避免剧烈震荡；

5. 快速处理：混合样品应立即进行电击，防止膜电位变化失衡。

四、样本类型分类与特点

1. 细菌样本

以大肠杆菌（E. coli）为代表的原核细胞体积小、膜厚、对电击耐受性高。
特点：

• 易制备高活性感受态；

• 转化效率受盐浓度与电场强度影响明显；

• 使用 0.1 cm 或 0.2 cm 电穿孔杯效果较好。

2. 酵母及真菌样本

细胞壁较厚，导入效率低于细菌，但可通过酶解预处理改善。
特点：

• 需去除细胞壁或使用酶解法形成原生质体；

• 含高渗保护剂（如山梨醇、甘露醇）以维持形态；

• 电压与电容需高于细菌体系。

3. 哺乳动物细胞

膜结构脆弱，对电击极为敏感。
特点：

• 需在等渗缓冲液中处理；

• 方波模式优于指数衰减波；

• 电击后迅速复苏以提高存活率。

4. 植物原生质体

去壁细胞，体积大，需中强度电场。
特点：

• 操作环境需高渗；

• 细胞数量控制精确；

• 电击后需补充Ca²⁺促进膜修复。

五、感受态细胞制备

1. 细菌感受态

以大肠杆菌为例：

步骤

1. 取单克隆菌落接种入5 mL LB液体培养基，37℃振荡过夜；

2. 次日1:100比例接种入新鲜LB培养基；

3. 培养至OD600≈0.5（对数生长期）；

4. 置冰上冷却10 min以抑制代谢；

5. 4℃、4000 rpm离心10 min，弃上清；

6. 用预冷无菌10%甘油溶液洗涤三次；

7. 最终重悬于少量10%甘油中（约2×10⁹ cells/mL）；

8. 分装至无菌离心管，置冰上待用或-80℃保存。

注意事项

• 培养基必须不含盐（NaCl等）残留；

• 洗涤液使用无离子甘油可显著降低电导；

• 细胞状态对电转化效率影响显著，过老或过嫩均不宜使用。

2. 酵母感受态

步骤

1. 培养至对数期，离心收集细胞；

2. 用1.2 M山梨醇缓冲液洗涤2次；

3. 以溶壁酶或Zymolyase处理30 min制备原生质体；

4. 再次离心洗涤并重悬于高渗缓冲液中；

5. 置冰上备用。

要点

• 原生质体制备需在无菌条件下完成；

• 电穿孔时液体体积控制在40–60 μL；

• 电击后立即加入山梨醇复苏液防止破裂。

3. 动物细胞样本

准备步骤

1. 将细胞培养至70–80%融合度；

2. 使用胰酶轻柔消化，离心收集；

3. 用无Ca²⁺、无Mg²⁺ PBS洗涤2次；

4. 重悬于等渗电穿孔缓冲液（如Cytoporation Buffer）中；

5. 计数调整至1×10⁶ cells/mL；

6. 放置冰上备用。

注意事项

• 避免细胞聚集或气泡；

• 所有缓冲液需过滤除菌；

• 不可使用含血清或盐分高的培养液。

六、核酸样品准备

1. 质粒DNA

电穿孔对DNA纯度要求极高。
要求与处理：

• 纯度A260/A280应在1.8–2.0；

• 彻底脱盐，避免任何Tris、NaCl、EDTA残留；

• 溶解介质推荐无离子水或低离子缓冲液（如TE 1:100稀释）；

• 储存于-20℃，使用前置冰解冻。

浓度建议

• 对细菌：10–100 ng/μL；

• 对动物细胞：1–5 μg/mL；

• 过高浓度会导致电导率上升，增加电弧风险。

2. RNA与蛋白样品

RNA或蛋白转染样品应保持结构完整。

• RNA样品需避免RNase污染；

• 蛋白样品应保持缓冲液电导率低且pH 7.0–7.4；

• 可在电击前加入稳定剂如甘油或蔗糖以保护样品。

七、混合与上样

1. 混合比例

一般情况下，DNA与感受态细胞体积比例为1:20至1:40。
例如：

• 40 μL细胞 + 1–2 μL DNA。

2. 操作步骤

1. 将感受态细胞加入至预冷电穿孔杯；

2. 加入DNA样品轻轻混匀；

3. 确保液面平整无气泡；

4. 放置冰上待电击，不超过2分钟。

3. 关键要点

• 所有操作均应在冰上完成；

• 混合后应立即进行电击；

• 若出现气泡，应弃样重新配制。

八、样品温度与离子控制

电穿孔过程中能量释放迅速，会导致局部加热。若样本温度过高，细胞会迅速死亡。
温度控制措施：

• 电击前样品保持在0–4℃；

• 电击后立即加入预温复苏液（37℃），避免温差冲击；

• 每次电击间隔至少5分钟，使电极降温。

离子浓度控制：

• 使用去离子水或低离子甘油溶液制备细胞悬液；

• 避免NaCl、KCl、Tris等强电解质；

• 若必须加入离子组分，应控制在1–5 mM以下。

九、电穿孔后的样品处理

1. 立即复苏
   电击结束后，在杯中迅速加入1 mL预温SOC或特定复苏液；

2. 轻柔混匀
   避免剧烈摇动，防止受损细胞破裂；

3. 复苏培养

• 对细菌：37℃摇床复苏1小时；

• 对动物细胞：37℃、5% CO₂培养2–4小时后更换新培养基；

4. 检测与保存

• 电转后取部分样品接种平板验证阳性克隆；

• 余下样品可冷冻保存以供分析。

十、常见问题与解决方案

十一、实验记录与质量控制

在样本准备过程中，应建立详细记录表，包括：

• 样品编号与制备时间；

• 感受态细胞OD值与保存条件；

• DNA浓度与纯度；

• 电击参数及时间常数；

• 电击前后样品体积与温度。

记录数据用于质量追踪与后期实验优化。

十二、样本准备的自动化与优化方向

随着实验室自动化的发展，部分样本制备流程已可通过机器人系统实现。
未来优化方向包括：

1. 自动温控与搅拌系统：确保混合均匀且温度恒定；

2. 微流控上样系统：精确控制电场作用体积；

3. 低离子仿生缓冲液：在保持生理稳定的同时减少电导率；

4. 预警检测机制：实时监控导电率与温度，防止电弧。

十三、厂家服务与技术支持

长沙实了个验仪器制造有限公司 为伯乐 Gene Pulser Xcell 系列设备的授权技术服务单位，提供：

• 原厂耗材供应与电穿孔杯更换；

• 样品制备指导与标准操作培训；

• 定期校正与性能检测；

• 三年质保，只换不修，确保实验安全高效；

• 提供定制化参数优化方案。

该服务体系确保科研人员在样本准备与仪器使用全过程中获得专业技术保障。

十四、总结

样本准备是电穿孔实验的核心环节。无论是细胞活性、DNA纯度、缓冲液组成，还是温度与离子浓度的控制，均直接影响导入效果。

通过科学、系统的准备流程，可显著提升实验稳定性与转化效率。Gene Pulser Xcell 电穿孔仪凭借精准的脉冲控制与可靠的硬件系统，为各种细胞类型的基因导入提供理想平台。在厂家长沙实了个验仪器制造有限公司的技术支持与质保体系下，研究人员能够安全、稳定地开展长期实验工作，确保数据真实可靠。