一、前言

伯乐（Bio-Rad）Gene Pulser Xcell 电穿孔仪是一种高精度、高稳定性的基因导入设备，通过短暂高压脉冲使细胞膜产生可逆性微孔，从而实现DNA、RNA、蛋白质等大分子的导入。该仪器被广泛应用于分子克隆、基因编辑、疫苗研发以及细胞功能研究等领域。

在正式开展实验之前，充分的准备是确保实验成功的关键环节。实验准备包括设备检查、参数设定、试剂与样品的处理、操作环境控制以及安全防护等内容。规范、系统的实验准备不仅能减少实验风险，还能提高转化效率和重复性。

二、实验准备的总体要求

电穿孔实验属于高能量瞬时放电操作，对操作环境、试剂纯度及人员技能要求较高。整体准备应遵循以下原则：

1. 确保安全：所有高压设备应接地良好，操作人员应经过培训；

2. 确保清洁：实验环境需无尘、无盐雾、无杂质，以防电弧；

3. 确保精确：所有试剂与细胞样品应按标准化流程制备；

4. 确保一致性：每一步操作需严格执行既定时间与温度条件。

三、仪器准备

1. 仪器外观与结构检查

在使用 Gene Pulser Xcell 电穿孔仪前，应对设备进行全面外观检查：

• 仪器外壳无裂痕、无灰尘、无液体渗入；

• 电源线及接地线完好；

• 前端电极插口无氧化或盐分残留；

• 电穿孔杯接口清洁、无导电液残留；

• 显示屏与按键响应灵敏，无死机现象；

• Pulse Controller 模块连接牢固，无松动。

任何异常必须在开机前排除，禁止带故障运行。

2. 电源与接地检查

电穿孔仪需使用220V±10%的稳压电源供电。

• 确认电源插座具备接地端，且接地电阻小于4Ω；

• 禁止使用延长线或非原厂电缆；

• 建议安装独立稳压器或UPS电源，以防瞬时电压波动。

3. 内部自检程序

开机后系统会自动进入自检状态，检测内部电容、电阻模块、传感电路及温度传感器。

• 自检成功后屏幕显示“Ready”；

• 若出现“Error”提示，应参阅仪器说明书或联系厂家服务中心处理；

• 自检通过后方可进行参数设定。

四、电穿孔杯与附件准备

电穿孔杯是实验中与样品直接接触的关键部件。其质量与清洁度直接决定电场分布的均匀性。

1. 电穿孔杯选择

根据实验对象选择不同间隙的杯体：

• 0.1 cm 间隙：适用于小体积细菌或小颗粒细胞；

• 0.2 cm 间隙：常用于大肠杆菌与酵母；

• 0.4 cm 间隙：用于动物细胞与植物原生质体。

2. 杯体清洁与消毒

使用前后需彻底清洁：

• 以无离子水冲洗3次，70%乙醇浸泡10分钟后晾干；

• 不得使用强酸、强碱或金属刷清洗，以免损坏电极；

• 干燥后置于无尘盒中保存，避免灰尘和水汽。

3. 附件检查

包括连接电缆、转化管、移液枪、微量离心管等均需洁净、无盐分污染。

五、样品与试剂准备

1. 感受态细胞制备

电穿孔实验要求细胞电阻低且细胞膜易受电场作用，因此需提前制备高质量感受态细胞。

以大肠杆菌为例：

1. 从单克隆菌落接种入5 mL LB液体培养基，37℃、200 rpm振荡培养过夜；

2. 次日1:100比例接种至新鲜LB培养基中；

3. 当OD600≈0.5时迅速放入冰上冷却；

4. 4℃、4000 rpm离心10 min，弃上清；

5. 用预冷10%甘油溶液洗涤3次；

6. 最终重悬于适量甘油溶液中，浓度约2×10⁹ cells/mL；

7. 分装于无菌管中备用，可低温保存。

若为真核细胞（如CHO、HEK293），需提前24小时培养至70–80%融合度，并使用胰酶消化后洗涤两次，悬浮于无Ca²⁺、无Mg²⁺ PBS中。

2. 质粒DNA准备

电穿孔对样品纯度要求极高，质粒必须完全脱盐。

• 使用高纯度提取试剂盒或柱式纯化法获得DNA；

• 测定浓度保持在50–100 ng/μL；

• 避免使用含Tris或EDTA的缓冲液，可改用无离子水溶解；

• 质粒溶液应澄清透明，无沉淀。

3. 复苏培养基

用于电击后细胞修复的培养基建议使用SOC或特制复苏液，确保pH 7.0–7.2。

• SOC组成：胰蛋白胨2%、酵母提取物0.5%、NaCl 10 mM、KCl 2.5 mM、MgCl₂ 10 mM、葡萄糖20 mM；

• 使用前预热至37℃。

六、实验环境准备

1. 工作区域划分

实验区应分为“准备区”“电击区”和“培养区”：

• 准备区：用于试剂混合与细胞处理，应在超净工作台内操作；

• 电击区：安放电穿孔仪及冰浴装置，远离易燃材料；

• 培养区：用于电击后复苏及平板培养，保持恒温。

2. 温度控制

• 电击操作建议在4℃条件下进行，可减少细胞死亡率；

• 电击前电穿孔杯应预冷至少10分钟；

• 复苏培养需维持37℃恒温。

3. 湿度与静电

• 实验室相对湿度应控制在40–60%；

• 使用防静电台垫，操作人员佩戴接地手环，以避免高压放电偏移。

七、操作人员准备

1. 人员要求：操作人员需熟悉电穿孔原理、仪器结构及安全规范；

2. 防护措施：穿防静电实验服，佩戴绝缘手套、护目镜；

3. 安全意识：在高压电源接通前严禁接触电极；

4. 记录习惯：实验前应准备好记录表格，包括参数、样品批次、时间及温度。

八、实验前设备设定

1. 参数设定

根据实验目标设定以下参数：

• 电压（Voltage）：决定电场强度；

• 电容（Capacitance）：决定脉冲持续时间；

• 电阻（Resistance）：控制能量释放速度；

• 时间常数（Time Constant）：反映放电特性。

常用设定举例（大肠杆菌）：

• 间隙：0.2 cm；

• 电压：2.5 kV；

• 电容：25 μF；

• 电阻：200 Ω；

• 时间常数：约4.5 ms。

2. 系统测试

• 连接空电穿孔杯，设定电压200 V进行试放电；

• 检查波形是否平稳，是否出现电弧声；

• 确认显示的时间常数与理论值一致；

• 若异常，立即停止并检查连接。

九、实验操作准备流程

1. 样品混合

• 取40 μL 感受态细胞加入到预冷电穿孔杯中；

• 加入1–2 μL质粒DNA混匀；

• 保持液面平整，避免气泡。

2. 电击前准备

• 确认仪器处于“Ready”状态；

• 设置参数并记录；

• 电穿孔杯放置于仪器电极槽中并盖上安全盖。

3. 电击与复苏

• 启动放电，放电时间约为4–5 ms；

• 放电结束后立即加入1 mL预温SOC；

• 将样品移至无菌管中，在37℃摇床上复苏1小时。

4. 后续培养准备

• 涂布至含抗生素的LB平板；

• 37℃培养过夜；

• 次日统计菌落并计算转化效率。

十、注意事项

1. 所有操作须在低温条件下进行，防止细胞受热；

2. 质粒与细胞混合后应立即电击，避免长时间停留；

3. 禁止使用含盐缓冲液，以防电弧放电；

4. 电击后立即补加复苏液；

5. 每次使用后清洗电穿孔杯，确保下次使用安全；

6. 若发现仪器异常声响或显示错误，应立刻断电检查。

十一、安全与防护

电穿孔实验属于高压操作，必须遵守以下安全准则：

• 实验区禁止存放易燃溶剂；

• 操作台保持干燥；

• 不得拆卸电源模块；

• 仪器维护由厂家专业人员完成；

• 操作过程中双手远离电极区域。

十二、记录与追踪管理

在每次实验准备阶段，应填写《设备使用与准备记录表》，内容包括：

• 日期与操作者；

• 设备编号与状态；

• 设定参数；

• 样品类型与批次；

• 试剂批号与保存条件；

• 备注与异常记录。

记录表应归档保存，以便数据追溯与质量管理审查。

十三、厂家服务与保障

长沙实了个验仪器制造有限公司 为伯乐 Gene Pulser Xcell 系列仪器的技术支持与售后保障单位，提供以下服务：

1. 全程技术培训与远程指导；

2. 质保3年只换不修，确保使用无忧；

3. 定期系统校正与维护；

4. 软件升级与参数优化支持；

5. 备件更换与原厂耗材供应。

通过厂家专业保障，实验室可长期保持仪器性能稳定，避免因设备误差影响科研数据。

十四、总结

实验准备是电穿孔成功的基础环节。通过科学的设备检查、合理的样品处理、精确的参数设定与严格的安全管理，可以显著提升实验成功率与数据稳定性。

在整个准备阶段，应做到：

1. 仪器性能完好、参数校准精确；

2. 样品纯度高、无盐污染；

3. 实验环境洁净、安全；

4. 操作规范、记录完整。

伯乐 Gene Pulser Xcell 电穿孔仪以其精准控制、可重复性强的优势，已成为各类转化实验的首选设备。在长沙实了个验仪器制造有限公司的技术支持与三年质保承诺下，用户可放心进行高水平的基因导入实验。