赛默飞3500系列遗传分析仪器设置详解

一、前言

Applied Biosystems 3500 和 3500xL 遗传分析仪是赛默飞公司推出的基于毛细管电泳技术的高性能DNA片段分析平台。其广泛应用于法医学、群体遗传学、分子生物学、微生物研究和个体识别等领域，以操作自动化程度高、结果重复性好、信号稳定清晰著称。

正确设置3500分析仪是确保实验顺利进行和获得高质量结果的基础。仪器初装调试、运行参数设定、数据采集方法配置、光谱矩阵校准、模板建立、运行文件编制等每一个环节都需精准操作。本文将围绕设备结构、系统组件、参数配置、校准方法、运行模块、分析模板、常见问题设定等方面，对赛默飞3500分析仪的完整设置流程进行系统性阐述。

二、设备组成概览

在设置前，用户应熟悉设备的核心硬件结构及相关部件功能：

• 电泳模块（Capillary Array）：8或24通道毛细管，负责DNA片段的电泳分离。

• 激光检测系统：采用固态激光激发多色荧光染料。

• CCD探测器：接收荧光信号并转换为数字图像数据。

• 自动进样系统：控制样本的吸取与注入。

• 聚合物泵送系统：将POP聚合物注入毛细管以维持电泳环境。

• 温控系统：控制毛细管运行环境温度（一般为60℃）。

• 废液系统：收集聚合物与电泳残液。

• 用户界面与运行软件：Data Collection、GeneMapper、SeqScanner等。

三、系统初始化与配置前准备

1. 环境要求

• 温度：20~25℃；

• 湿度：≤60%；

• 电源：220V/50Hz，具备UPS；

• 避免阳光直射、强磁干扰。

2. 设备检查

• 检查聚合物瓶、电泳缓冲液、废液瓶是否安装正确；

• 检查毛细管阵列安装是否到位；

• 样本盘位置对准，检查自动进样托盘是否平稳；

• 软件系统连接状态无误，仪器主界面无报警标志。

四、仪器设置流程总览

赛默飞3500分析仪的完整设置主要包括以下几个步骤：

1. 新建仪器模板与运行模块

2. 光谱校准（Spectral Calibration）

3. 空间校准（Spatial Calibration）

4. 仪器设置参数配置

5. 样本文件与运行文件创建

6. 分析方法模板（Analysis Method）配置

7. 数据路径与项目管理设置

8. 质量控制参数设定

五、仪器模板与运行模块配置

1. 运行模块（Run Module）设置内容：

• 毛细管电压：通常设置在13.5kV–15kV之间；

• 进样电压/时间：例如1.2kV/15秒（依试剂盒说明书）；

• 运行时间：按目标片段大小选择，如1200秒用于≤500bp片段；

• 温度控制：默认设定为60℃；

• 缓冲液类型：与试剂盒匹配，如使用Hi-Di Formamide；

• Dye Set选择：如Dye Set J、G5、D等，匹配染料组合。

可根据实验目的（STR分析、测序、片段分析）设定不同的运行模块并命名保存。

六、光谱矩阵校准（Spectral Calibration）

1. 校准目的

分离不同荧光染料通道，避免信号重叠，确保每种染料信号被正确识别。

2. 校准流程

• 使用Spectral Calibration标准品（如 DS-33 或 DS-30）；

• 设置染料类型与使用通道；

• 运行光谱采集程序；

• 软件自动计算色谱矩阵；

• 保存并应用校准结果。

建议每两个月或更换毛细管、电泳缓冲液、染料种类后重新校准。

七、空间校准（Spatial Calibration）

1. 校准目的

确保多通道毛细管在CCD上对应的检测位置一致，避免峰错位。

2. 操作流程

• 插入空间校准板；

• 运行空间校准模块；

• 检查图像文件是否稳定、对称；

• 若失败，检查进样臂移动轨迹和通道洁净度。

建议每季度进行一次，或在更换毛细管后执行。

八、分析方法与模板建立

1. Analysis Method设置

• Basecaller：用于Sanger测序；

• Sizing Method：用于片段大小计算；

• Peak Detection：设置最低峰值强度阈值；

• Baseline Window：定义基线范围，如51点移动平均；

• Size Standard设置：如LIZ500、LIZ600等；

• Ladder or Standard Migration Correction：执行迁移率修正。

2. 数据路径配置

• 设置样本数据的存储目录；

• 每个项目建立独立文件夹便于数据管理；

• 可启用自动命名规则提高追踪性。

九、样本文件与运行文件创建

1. Sample Sheet文件

包含以下字段：

• 样本编号；

• 样本位置信息（A01–H12）；

• 分析方法模板名称；

• 使用染料类型与Size Standard名称；

• Project名称与数据保存路径。

2. Plate文件创建

• 指定样本文件所用样本板类型（96孔或384孔）；

• 与样本工作表对应；

• 选择运行模块；

• 命名该次运行并保存。

创建完成后在仪器主界面选择该运行任务，确认无误后启动分析。

十、质量控制参数设置

1. Signal Intensity设置

• 建议将最小峰高设置为100–150 RFU；

• 峰宽限制在7–20数据点之间；

• 建议开启“Pull-Up”检测以排除染料串扰。

2. 重复样本验证

• 每次分析包含一个重复样本；

• 检查峰值迁移位置是否一致；

• 若出现≥0.3 bp偏差，可能存在温控异常或毛细管堵塞。

十一、常见设置错误与处理建议

十二、仪器设置维护与更新建议

• 每季度进行一次全系统校准；

• 使用原厂耗材以确保兼容性；

• 每次软件升级后重新验证运行模块有效性；

• 建议使用统一命名规范进行方法模板管理；

• 设置管理员与操作员不同权限，防止参数误改；

• 定期备份系统设置文件和分析方法模板。

十三、结语

赛默飞3500系列遗传分析仪在分子生物学与法医学研究中发挥着不可替代的作用。其分析结果的可靠性、片段分型的准确性以及高通量处理能力，都建立在科学严谨的仪器设置基础之上。通过规范化仪器设置流程、精细化参数配置、持续性运行校准、智能化软件管理，可以大幅提升实验数据质量、减少运行故障、降低返工风险。

仪器设置不仅是技术工作的起点，更是质量控制体系的关键环节。建议实验室依据自身项目需求，制定定期校验制度与设置模板库，实现全流程标准化与实验操作一致性，从而打造一个高效、准确、稳定的实验环境。