一、校准的重要性
确保数据的准确性
校准能够消除因光学元件老化、电子漂移或环境变化所带来的系统误差，使每次测量都基于真实的标准基准进行比较。提高分析结果的可重复性
多批次、多仪器之间的数据一致性依赖于标准化的校准方法，减少人为和系统因素带来的差异。符合监管要求
GMP、GLP、ISO等法规体系要求对分析设备进行定期校准，并留存完整的操作记录与验证报告。提升仪器性能寿命
通过校准发现并预警潜在硬件问题，有助于延长设备寿命并降低维护成本。
二、赛默飞3500校准方式概述
赛默飞Evolution 3500支持多种自动或手动校准方式，包括：
波长校准
光度准确度校准（吸光度）
杂散光校准
分辨率校准
基线校准与背景校正
噪声与漂移校准
量程线性校准
多点定量校准（定标曲线）
每种校准方式针对仪器性能的不同方面，需根据使用频率、测量精度和法规要求设定周期性维护计划。
三、波长校准
1. 原理
通过识别已知标准物质发出的特定波长信号，将仪器光栅调节系统检测的实际波长与理论值进行比较，对存在的偏差进行修正。
2. 操作流程
打开软件（如INSIGHT或OMNIC）并选择“波长校准”功能。
插入标准滤光片（如钬玻璃）或启动汞灯。
扫描已知波长区域（如200~700nm）。
软件自动匹配标准谱线，计算偏差。
偏差在允许范围（±0.3nm）内为合格，超出则自动调节光栅系统。
3. 常用标准
| 参考源 | 标准波长（nm） |
|---|---|
| 钬玻璃 | 361, 486, 536, 638 |
| 汞灯 | 253.7, 365, 435.8, 546.1 |
四、光度校准（吸光度准确度）
1. 原理
使用已知吸光度值的标准溶液或滤光片对仪器测得吸光度进行比对，评估其测量精度。
2. 操作方法
准备一系列标准吸光度滤片（如0.2A, 0.5A, 1.0A等）或校准溶液（如钾二铬酸盐、钴/镍标准液）。
在特定波长（如235nm、257nm、440nm）处测量其吸光度。
与证书标准值比较，允许误差一般为±0.005~±0.010A。
记录各项偏差，并保存校准报告。
3. 适用范围
适用于定量分析和方法验证的实验室使用，尤其重要于药物浓度测量与法定检测场合。
五、杂散光校准
1. 原理
杂散光是指非目标波长光线的干扰信号，会导致低吸光度样品测试误差增大。该校准用于检测并评估杂散光水平。
2. 校准材料与波长设置
| 标准物质 | 波长区域 | 预期吸光度 |
|---|---|---|
| 钠硝酸盐溶液 | 220 nm | >2.0 |
| 钾氯化物溶液 | 200 nm | >1.5 |
| 乙醛溶液 | 270 nm | >3.0 |
3. 操作说明
将标准溶液放入比色皿。
扫描目标波长下的吸光度。
若吸光度远低于标准，说明存在杂散光问题，需检查光学元件或更换光源。
六、分辨率校准
1. 目的
检测仪器是否能分辨相邻两个非常接近的光谱峰。分辨率不良可能导致峰重叠、定性错误。
2. 校准方法
使用苯、甲苯、钬玻璃等标准物质。
在255nm附近扫描苯的紫外吸收峰。
分析主峰与肩峰的波长差异与谷深度，计算分辨比。
通常要求分辨比大于1.5，峰距＞1.0nm。
七、基线校准与背景校正
1. 作用
确保仪器在无样品状态下的信号为“零”或近零状态，以消除基线漂移。
2. 操作流程
清空比色架，插入空白比色皿。
启动“背景校正”功能。
系统自动扫描当前背景噪声并设为零基线。
执行时间范围内的基线稳定性观察。
八、噪声与稳定性测试
1. 噪声校准
在无样品条件下设定波长（如500nm）并连续读取空白吸光度。
噪声值应小于±0.001A（视型号而定）。
2. 漂移校准
记录某一波长处的吸光度连续变化（30分钟或以上）。
判断是否存在趋势性偏移，指标应符合技术手册要求。
九、量程线性与定量校准
1. 线性测试
使用一组不同浓度的标准溶液（例如钾二铬酸盐、铜离子等）。
在目标波长下测定吸光度并绘制浓度-吸光度曲线。
计算线性回归系数R²，应大于0.999。
2. 多点定量校准
用软件内建功能设定多点标准曲线。
自动生成斜率、截距、回归系数，作为定量依据。
存档用于日常样品浓度推算。
十、校准周期与建议
| 校准类型 | 推荐频率 |
|---|---|
| 波长校准 | 每周或每次关键实验前 |
| 吸光度校准 | 每月一次或换灯后执行 |
| 杂散光校准 | 每季度一次 |
| 分辨率校准 | 每季度一次 |
| 定量校准 | 每次实验前或方法建立时 |
| 噪声测试 | 每月一次 |
| 背景校正 | 每次实验前 |
所有校准操作均应有详细记录，并纳入仪器使用档案。
十一、常见问题与处理策略
| 问题 | 可能原因 | 解决方法 |
|---|---|---|
| 波长偏移严重 | 光栅松动、光源老化 | 重新校准光栅系统，更换光源 |
| 吸光度不准 | 滤片污染、光源稳定性差 | 清洁滤片，检查灯源 |
| 杂散光大 | 光学腔污染、窗口划伤 | 清洁光学部件，必要时联系维修 |
| 线性回归系数低 | 标准溶液制备误差大 | 重新配制标准液，严格操作规程 |
| 背景漂移频繁 | 环境温度变化、电子噪声干扰 | 保持室温稳定，检查电源干扰 |
十二、总结
赛默飞3500系列分光光度计提供了多种完善的校准方式，涵盖从基础波长到高阶定量测量的全方位仪器验证机制。掌握这些校准技术，不仅可以有效提升测量精度，还能帮助实验室在质量管理和审计合规中占据主动。建议实验室建立标准操作程序（SOP），指定专人执行定期校准，并形成闭环管理流程。通过科学系统的校准维护，仪器可持续提供稳定、高质量的数据支持，为各类分析任务提供可靠保障。
