一、现象概述

在使用 IX71 倒置荧光显微镜进行多通道成像时，色偏是较为常见的问题，主要表现为：单一通道颜色不纯、不同通道亮度失衡、合并图整体偏色，或同一结构在不同通道出现位置错位（彩边）。色偏不仅影响图像观感，更会直接干扰荧光共定位判断、信号强度比较以及批量实验的一致性。色偏并非单一环节失误造成，而是由光学配置、采集参数与后期处理多因素叠加形成，因此校正应遵循“先采集端、后显示端”的原则。

二、主要特点（色偏的典型类型）

1. 亮度色偏
   不同颜色通道之间亮度差异明显，合并后被某一通道“主导”，例如绿色过亮导致整体偏绿。此类问题多与曝光、增益、光源波段输出差异有关。

2. 色调偏移
   本应纯绿的 GFP 看起来发黄，红色通道偏紫或偏暗。常见原因包括相机白平衡、伽马校正、软件默认渲染方式不当。

3. 空间色偏（通道错位）
   合并图像边缘出现红绿分离或彩色重影，结构无法准确叠加。这通常与物镜色差校正、滤块位置差异、通道切换造成的光路偏移有关。

4. 局部色偏
   图像中心正常、边缘偏色或亮度不均，多与照明对中不良、视野不平或光路污染有关。

三、色偏成因解析（从硬件到采集的关键环节）

1）光学系统与滤块配置

• 滤块与染料不匹配：激发、发射波段与 GFP、RFP、DAPI 等染料不完全对应，会导致信号削弱或串色，从而引起亮度和色调偏差。

• 滤片污染或老化：灰尘、指纹或镀膜老化会改变透光率，不同通道受影响程度不同，容易形成系统性偏色。

2）光源与照明状态

• 光源衰减不均：灯泡老化后，各波段输出下降程度不同，绿光或红光通道可能明显变暗。

• 照明未对中：对中不良会导致不同通道的视野亮度分布不一致，合并后形成局部色偏。

3）物镜与样品匹配

• 物镜色差校正限制：在高倍或视野边缘，若物镜校正不足，容易出现彩边。

• 底材厚度不匹配：培养皿或孔板底部厚度偏离物镜设计值，会放大像差，使色偏更明显。

4）相机与采集参数

• 自动白平衡与自动增强：这些功能更适合普通摄影，在荧光成像中会人为改变通道关系。

• 曝光与增益策略不当：所有通道使用同一曝光，往往导致某些通道过曝、某些通道偏暗，合并后产生明显偏色。

四、色偏校正的规范流程

1）采集前的基础校准

• 确认滤块型号与所用染料匹配，清洁物镜前端与光路可触及表面。

• 检查光源状态，必要时重新对中照明，确保视野亮度分布均匀。

• 关闭相机或软件中的自动白平衡、自动色彩增强和非必要的伽马修正。

2）采集时的参数统一原则

• 分通道独立设定曝光与增益：以“不过曝、背景不过亮”为目标，使各通道信号落在相似的动态范围内。

• 固定采集顺序：弱信号通道优先采集，减少漂白带来的通道间差异。

• 统一采集模板：同一实验批次保持物镜、光阑、曝光策略一致，避免人为引入色偏。

3）采集后的校正与合并

• 亮度归一化：在显示层面对各通道使用一致的黑白场逻辑，避免某通道视觉上被放大。

• 平场校正：消除照明不均导致的局部亮度与颜色差异，使整个视野的通道响应一致。

• 通道配准：当出现空间错位时，可使用多色荧光微球或点状结构样本建立通道校正关系，再应用于同批图像。

• 克制调色：避免过度调整饱和度和伽马，防止制造假共定位或虚假结构。

五、应用实例

1. GFP 与 RFP 双标共定位实验
   通过分通道曝光优化与通道配准校正，可消除彩边，使共定位判断基于真实空间关系而非色偏假象。

2. 多孔板批量荧光筛查
   建立统一的通道参数与校正流程，能显著降低孔间、批次间的颜色差异，提高数据可比性。

3. 弱远红通道成像
   通过延长曝光、控制增益并统一显示范围，可避免因亮度不足导致的整体偏色与合并失真。

六、总结

IX71 倒置荧光显微镜的色偏校正，应从光学与采集端入手，而非依赖后期“调颜色”。通过确认滤块与染料匹配、保证光源与照明对中、合理设置各通道曝光与增益、关闭自动色彩功能，并在必要时进行平场与通道配准，可以有效解决亮度失衡、色调偏移与空间错位等问题。最终目标不是让图像更艳，而是让多通道结果真实、稳定、可复现，为定量分析和科研结论提供可靠的成像基础。