一、概述：多通道切换的核心逻辑

IX71 倒置荧光显微镜的多通道切换，本质是把同一视野中的不同荧光信号，分别通过对应的“激发—分光—发射”光学组合进行观察与成像。操作上可以理解为三步循环：选通道（滤光组）→调参数（光强/曝光）→采集记录。多通道做得稳定与否，关键不在“切得快”，而在“切得准且可重复”：同一位置、同一对焦、同一采集顺序、同一参数策略，才能保证通道之间可比、图像能叠加、结果能解释。

二、主要特点（为何要按流程切通道）

1）滤光组决定你看到什么颜色
每个通道对应一套滤光片组合，决定哪些波长被激发、哪些波长被采集。选错通道会导致信号变弱、背景变高，甚至出现串色。

2）通道切换会改变亮度与噪声
不同染料亮度差异很大，切通道后曝光与光强几乎一定需要调整。若不做通道独立参数管理，容易出现某通道过曝、某通道欠曝，影响叠加与定量。

3）多通道强调“先定位后采集”
倒置系统常用于培养皿、多孔板观察，样品可能不均匀。先用明场/相差定位目标，再切荧光逐通道拍摄，可以显著提高效率并减少光漂白。

三、操作逻辑清单（多通道切换的通用步骤）

1）先在明场或相差下完成定位与对焦

• 选择低倍物镜找到目标区域，再切换到需要的倍率精对焦。

• 明场/相差下对焦更快、对样品光损伤更小。

• 目标是让“焦点与视野”先稳定下来，再进入荧光通道循环。

2）确认通道配置与顺序（建议先规划）

• 明确你要采集的通道（例如：DAPI、FITC、TRITC、Cy5等）。

• 顺序建议：通常按“长波到短波”或按“最弱信号优先”两种策略来定：

• 长波到短波：可减少短波激发造成的额外漂白与非特异背景。

• 弱信号优先：避免强通道先照射导致弱通道被漂白后更难采。

• 通道越多，越需要固定顺序并写入实验记录，方便复现。

3）切换通道的具体动作（显微镜侧 + 软件侧）

• 显微镜侧：切换滤光块/滤光转盘到对应通道位置；确认光路输出到相机端（不是目镜端）。

• 软件侧：选择相机、选择通道预设（若有），然后设置曝光时间、增益、位深、binning等参数。

• 每切一个通道，都按“先确认滤光组 → 再调整曝光 → 再拍摄”执行，避免把曝光调好却通道没切对。

4）曝光与光强的设定原则（避免过曝与漂白）

• 优先通过降低光强配合合适曝光获取信号，而不是一味提高增益。

• 目标是让信号在动态范围内不过曝（高亮区域不“发白”），背景尽量低。

• 多通道拍摄时每个通道建立独立参数，不要用同一曝光套所有颜色。

5）保证叠加准确：对焦与位移控制

• 如果通道切换后出现轻微焦面变化，可做小幅微调，但尽量减少反复照射。

• 若平台有电动载物台或多点位采集，建议先在一个点位把通道参数调定，再复制到其他点位，避免每个点位重复试光造成漂白。

6）采集方式选择：单张、顺序多通道、批量/多点位

• 单视野多通道：最常用，适合共定位与形态观察。

• 多点位多通道：适合多孔板或统计学实验，重点是参数一致性。

• 时间序列多通道：适合动态过程，但要特别控制光剂量与通道数量，避免光毒性。

四、应用实例（典型多通道工作流）

实例1：免疫荧光三通道共定位

• 明场定位细胞层 → 切 DAPI 拍核 → 切 FITC 拍目标蛋白 → 切 TRITC 拍骨架。

• 每通道独立曝光，最后用软件叠加评估定位关系。

• 若发现串色，可通过缩短曝光、降低光强或调整采集顺序改善。

实例2：转染效率与对照同屏比较

• 同一视野先拍明场记录细胞状态 → 切 GFP 通道统计阳性 → 切红色通道做对照标记。

• 固定曝光与增益用于不同样品对比，避免因参数变化造成“看起来更强”的假差异。

实例3：多孔板批量采集

• 先在一个孔内调好所有通道参数并保存为模板 → 设定孔位与点位 → 一键批量采集。

• 这样能减少人为切换误差，提高通量与一致性。

五、总结（把多通道切换变成可复现SOP）

IX71 的多通道切换可以记成一句话：明场定位定焦 → 按固定顺序切滤光组 → 每通道独立设曝光与光强 → 采集并记录参数。多通道成像最怕“边切边试、参数随手改”，那样会带来漂白、串色与不可比。建立通道顺序、曝光模板和记录习惯后，多通道就能从“能拍到”升级为“可叠加、可比较、可分析”，更适合科研与平台化使用。