一、现象概述

在 IX71 倒置荧光显微镜上观察或拍摄 RFP（红色荧光蛋白）时出现“偏暗”，常见表现包括：目镜下勉强可见但相机成像很弱、红通道对比度低、同一视野中 GFP 很亮而 RFP 发虚、曝光拉长后背景迅速变脏。RFP 偏暗并不一定是光源“不给力”，更多时候是通道匹配、光路分配、物镜通光、采集参数与样品状态共同作用的结果。处理目标不是单纯把画面变亮，而是在控制光漂白与噪声的前提下提高有效信噪比，让红通道既清晰又可重复。

二、主要特点（RFP在显微成像中的关键难点）

1）谱型差异大，滤块不匹配会直接变暗
RFP并非单一品种，不同红色蛋白（如 DsRed、mCherry、tdTomato 等）激发/发射峰值不同。滤光块中心波长偏离或带宽过窄，会让激发“打不到位”或发射“收不全”，结果就是整体偏暗。

2）红光检测端更容易吃亏
不少相机在 600–700 nm 的量子效率低于绿光区，红通道先天会弱一些。若再叠加增益设置不当或读出噪声偏高，就会出现“怎么调都不如绿通道亮”的主观感受。

3）背景与自发荧光会吞掉弱信号
培养基、塑料耗材、固定剂残留等造成的背景抬升，会让 RFP 的对比度明显下降。很多情况下问题不是“RFP不亮”，而是“红通道背景太高”。

三、调节步骤（从最快见效到深入优化）

1）先核对通道配置：滤光块是第一优先级

• 确认红通道滤块类型：优先使用专用的 RFP/mCherry/TxRed 类滤块，避免用 TRITC/Cy3 之类“近似红通道”凑合。近似滤块往往会损失一部分激发或发射能量。

• 检查滤块是否到位与洁净：滤块未卡紧、装反、表面有灰尘油污，都会显著降低透过率，弱信号下尤为明显。

• 快速验证法：如果更换另一套红通道滤块后明显变亮，基本可锁定为滤片谱型不匹配或滤片老化/污染导致的能量损失。

2）确认光路分配：别把光“分走了”

• 检查三目分光状态：拍照时确保更多光量进入相机端，而不是被分配到目镜。很多“相机很暗、目镜还行”的情况，都是分光比例或切换位置导致。

• 避免不必要的中继件损耗：某些转接筒、分光器或附件会带来额外透过损失。红通道本来就弱时，这类损耗更敏感。

3）光阑与照明：在亮度与对比之间取平衡

• 孔径光阑不要收得过小：孔径过小会明显降低通光量，RFP会更暗。可以适当打开，提高采光效率。

• 视场光阑按需调整：过小会压暗画面，过大则增加杂散光导致背景升高。建议以“刚好覆盖视野”为思路，提高有效对比度。

• 照明对中与光纤端面清洁：若激发光耦合不佳或光斑偏心，会出现整体偏暗或局部不均，红通道更容易暴露问题。

4）光源策略：优先“延长曝光”而非“猛加灯强”

• 灯源状态评估：汞灯/金卤灯接近寿命末期时输出衰减，红通道常更先感到吃力。若多个通道同时变暗，应考虑光源衰减或光路污染。

• LED红激发功率设置：确认红激发通道未被设为低功率或处于限功率模式。

• 推荐做法：尽量用“较低激发强度 + 更合适的曝光”获得足够信号，减少光漂白与光毒，尤其是需要重复拍摄或时间序列时。

5）相机采集参数：把信号“采好”比“拉亮”更重要

• 先调曝光再调增益：RFP弱时，优先延长曝光获取更多光子；增益只作为补偿。增益过高会把背景噪声一起抬高，画面变亮但信息不增反降。

• 避免饱和与假亮：如果局部过曝，红通道细节会丢失，且背景更容易显脏。保持直方图不过顶能提升可用性。

• 降低不必要的高速读出：高速模式可能带来更大读出噪声，红通道弱信号下不划算。

• 合适位深采集：尽量使用更高位深保存原始数据，显示端再调 LUT，避免低位深造成“看起来灰暗、拉不起来”。

6）样品端优化：排除“表达与背景”问题

• 确认成熟时间与表达量：很多红色荧光蛋白成熟时间更长，转染后过早观察会明显偏暗。

• 减少背景来源：无酚红培养基、低自发荧光耗材、充分洗涤、避免固定剂残留，常能让红通道“立刻清爽”。

• 控制细胞密度与状态：细胞状态差或过密会导致信号弱、背景高，表现为“怎么调都暗”。

7）物镜与成像附件：通光效率差异非常大

• 优先选择高 NA 物镜：同倍率下 NA 更大意味着收光更强，RFP会明显变亮。

• 确认盖玻片/玻底厚度匹配：高 NA 物镜对厚度偏差敏感，厚度不对会导致像差增加、能量分散，看起来“又暗又糊”。

• 清洁关键光学面：物镜前镜、玻底皿底部、相机保护玻璃的污渍会降低对比度，红通道弱信号时影响更显著。

四、应用实例（常见场景如何快速处理）

实例1：GFP很亮，RFP特别暗
优先检查红通道滤块是否匹配 mCherry/RFP 谱型，以及相机红波段灵敏度与曝光设置；再检查是否用了近似滤块（如用TRITC替代RFP）。

实例2：目镜能看到，相机几乎黑
重点排查三目分光切换与相机端曝光/增益；把光路切到相机优先并延长曝光，通常立竿见影。

实例3：刚开始还行，拍几张就越来越暗
多为光漂白。降低激发强度、减少照明时间、用更长曝光替代更强光源，可显著改善稳定性。

五、总结（推荐的实用流程）

1）先“对通道”：确认红通道滤块匹配 RFP 谱型、滤块到位且清洁。
2）再“给到光”：拍照时把光路分配到相机端，孔径适当打开，照明对中。
3）后“采得好”：以延长曝光为主、增益为辅，避免饱和与高速噪声。
4）最后“看样品”：降低背景、保证成熟时间与耗材一致性，必要时更换高 NA 物镜或玻底皿。