技术文章
Technical articles为确保赛默飞 QuantStudio 5 实时荧光定量PCR仪的正确使用,提高实验效率,确保实验数据的准确性和重复性,特制定本操作规程。该规程适用于分子生物学、基因表达分析、核酸检测等相关实验中的PCR检测工作。
本规程适用于使用赛默飞 QuantStudio 5 实时荧光定量PCR仪进行核酸扩增和荧光定量检测的实验操作人员。适用场景包括科研实验室、医疗检测机构、食品和环境检测单位等。
QuantStudio 5 是赛默飞生命科学仪器平台推出的一款实时荧光定量PCR设备,具备96孔与384孔两种格式版本。该仪器配置灵敏的荧光检测系统和高精度温控模块,配套Design and Analysis软件进行数据处理和可视化分析,支持多种应用场景。
检测通道:最多支持6个荧光通道
荧光染料兼容性:FAM、SYBR Green、VIC、ROX、Cy5 等
样品通量:96孔(0.2 mL)或384孔板
温控精度:±0.25℃
升降温速率:最大4.0℃/秒
最小检测体积:10 μL(推荐),5 μL为限
光学系统:独立激发和发射滤光片,快速滤片切换
软件平台:QuantStudio Design and Analysis 软件
数据输出格式:Excel、PDF、CSV等
打开主机电源,检查设备状态灯是否正常(绿色为正常)
确保计算机与主机通过USB或局域网连接
启动QuantStudio软件,登录用户账户
检查样品舱是否干净,无液体残留或杂质
确保荧光滤光片和温控板无损伤、无污染
准备反应体系,包括引物、探针、酶、缓冲液及模板核酸
样本混匀后加样至PCR板或试管中,封板并轻轻离心去除气泡
样本总量建议控制在10–20 μL,确保PCR反应效率
使用推荐的光学透明封板膜,避免荧光信号干扰
使用专用PCR板(0.2 mL)和光学封板膜
样本添加顺序应按照软件设定模板进行,确保板位与样本对应
样品编号应统一命名,便于后续分析追踪
若实验涉及多个通道检测,确保荧光染料无交叉干扰
打开软件,点击“新建实验"
选择实验类型(定量PCR、熔解曲线分析、相对定量等)
选择荧光染料和检测通道,匹配实验方案
设定PCR扩增程序,如:
95℃ 15秒
60℃ 60秒(荧光采集)
初始变性:95℃ 10分钟
扩增循环(40 cycles):
设定板图:将样本、阴性对照、阳性对照、标准品标注至对应孔位
保存方法模板文件,便于重复使用
打开仪器样品舱,将96孔PCR板平稳放置在加热模块上
关闭样品舱盖,确保均匀受热
点击“开始运行"按钮,系统将执行程序并实时采集数据
实验过程中可查看扩增曲线,监测荧光信号变化
实验结束后,系统自动生成Ct值表格和扩增图
可进行标准曲线分析、基因表达比值计算、熔解曲线分析等
可导出数据报告,包括Ct值、扩增效率、图表等格式
根据需求保存为PDF、Excel或图像文件,进行后续统计分析
移除PCR板并按废物处理流程处置
用干净棉签或无尘纸巾清洁加热模块表面
关闭软件与主机,切断电源,盖好防尘罩
核查实验记录,补充试剂使用情况与样本处理信息
实验期间尽量避免样品舱打开,防止温控系统紊乱
PCR板应均匀加样,避免气泡产生或液体溢出
使用专用荧光染料,勿自行替换未验证的染料
实验过程中应佩戴防护手套,避免污染反应体系
所有样本及耗材使用后应规范处置,防止污染环境
每次使用前应检查仪器状态,出现异常及时联系维修人员
尽量使用模板文件,提高操作一致性与数据可比性
问题 | 原因分析 | 解决措施 |
---|---|---|
Ct值偏高或不一致 | 模板浓度低、移液误差、气泡干扰 | 重新提取模板,校验加样操作 |
无荧光信号 | 荧光探针降解、通道设置错误 | 更换探针,检查软件设置 |
曲线形态异常 | 反应液污染、酶失活 | 检查试剂有效期与保存方式 |
通道干扰 | 多重PCR染料重叠 | 调整检测通道设置或使用校正板 |
系统报错 | 软件故障或硬件接触不良 | 重启设备或联系技术支持 |
每次使用后进行外观清洁
保持仪器通风口畅通,防止过热
检查电源线、USB或网络连接状态
光学系统与温控模块应根据厂商推荐周期进行校准
可使用赛默飞提供的校准板进行自检
校准应由具备资格的人员或厂家技术支持人员执行
记录每次校准与维护结果,备查
实验操作遵守生物安全规定,使用生物安全柜处理高风险样本
荧光染料避免直接接触皮肤和眼睛
如遇试剂泄漏,立即使用70%乙醇或漂白剂进行清理
设备发生电气故障时,立即断电并通知相关技术人员处理
实验过程中如发现异常升温或烟雾,应立即停止运行并检查电源系统
成分 | 体积 | 说明 |
---|---|---|
2× qPCR Master Mix | 10 μL | 含酶和缓冲体系 |
引物(前/后) | 各0.4 μL | 最终浓度约200 nM |
探针或SYBR Green | 0.2–0.4 μL | 根据染料类型选择 |
模板DNA | 1–2 μL | 10–100 ng |
无核酸水 | 补足至20 μL | 保证总体积一致 |