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赛默飞 QuantStudio 5 荧光定量 PCR 仪操作规程

更新时间:2025-03-18点击次数:16

赛默飞 QuantStudio 5 荧光定量 PCR 仪操作规程

一、目的

为确保赛默飞 QuantStudio 5 实时荧光定量PCR仪的正确使用,提高实验效率,确保实验数据的准确性和重复性,特制定本操作规程。该规程适用于分子生物学、基因表达分析、核酸检测等相关实验中的PCR检测工作。

二、适用范围

本规程适用于使用赛默飞 QuantStudio 5 实时荧光定量PCR仪进行核酸扩增和荧光定量检测的实验操作人员。适用场景包括科研实验室、医疗检测机构、食品和环境检测单位等。

三、仪器简介

QuantStudio 5 是赛默飞生命科学仪器平台推出的一款实时荧光定量PCR设备,具备96孔与384孔两种格式版本。该仪器配置灵敏的荧光检测系统和高精度温控模块,配套Design and Analysis软件进行数据处理和可视化分析,支持多种应用场景。

主要技术参数:

  • 检测通道:最多支持6个荧光通道

  • 荧光染料兼容性:FAM、SYBR Green、VIC、ROX、Cy5 等

  • 样品通量:96孔(0.2 mL)或384孔板

  • 温控精度:±0.25℃

  • 升降温速率:最大4.0℃/秒

  • 最小检测体积:10 μL(推荐),5 μL为限

  • 光学系统:独立激发和发射滤光片,快速滤片切换

  • 软件平台:QuantStudio Design and Analysis 软件

  • 数据输出格式:Excel、PDF、CSV等

四、使用准备

1. 仪器开机检查

  • 打开主机电源,检查设备状态灯是否正常(绿色为正常)

  • 确保计算机与主机通过USB或局域网连接

  • 启动QuantStudio软件,登录用户账户

  • 检查样品舱是否干净,无液体残留或杂质

  • 确保荧光滤光片和温控板无损伤、无污染

2. 实验准备

  • 准备反应体系,包括引物、探针、酶、缓冲液及模板核酸

  • 样本混匀后加样至PCR板或试管中,封板并轻轻离心去除气泡

  • 样本总量建议控制在10–20 μL,确保PCR反应效率

  • 使用推荐的光学透明封板膜,避免荧光信号干扰

3. 模板与耗材管理

  • 使用专用PCR板(0.2 mL)和光学封板膜

  • 样本添加顺序应按照软件设定模板进行,确保板位与样本对应

  • 样品编号应统一命名,便于后续分析追踪

  • 若实验涉及多个通道检测,确保荧光染料无交叉干扰

五、操作流程

1. 实验设置

  • 打开软件,点击“新建实验"

  • 选择实验类型(定量PCR、熔解曲线分析、相对定量等)

  • 选择荧光染料和检测通道,匹配实验方案

  • 设定PCR扩增程序,如:

    • 95℃ 15秒

    • 60℃ 60秒(荧光采集)

    • 初始变性:95℃ 10分钟

    • 扩增循环(40 cycles):

  • 设定板图:将样本、阴性对照、阳性对照、标准品标注至对应孔位

  • 保存方法模板文件,便于重复使用

2. 加载样品与运行

  • 打开仪器样品舱,将96孔PCR板平稳放置在加热模块上

  • 关闭样品舱盖,确保均匀受热

  • 点击“开始运行"按钮,系统将执行程序并实时采集数据

  • 实验过程中可查看扩增曲线,监测荧光信号变化

3. 实验完成与数据分析

  • 实验结束后,系统自动生成Ct值表格和扩增图

  • 可进行标准曲线分析、基因表达比值计算、熔解曲线分析等

  • 可导出数据报告,包括Ct值、扩增效率、图表等格式

  • 根据需求保存为PDF、Excel或图像文件,进行后续统计分析

4. 实验结束后的处理

  • 移除PCR板并按废物处理流程处置

  • 用干净棉签或无尘纸巾清洁加热模块表面

  • 关闭软件与主机,切断电源,盖好防尘罩

  • 核查实验记录,补充试剂使用情况与样本处理信息

六、注意事项

  1. 实验期间尽量避免样品舱打开,防止温控系统紊乱

  2. PCR板应均匀加样,避免气泡产生或液体溢出

  3. 使用专用荧光染料,勿自行替换未验证的染料

  4. 实验过程中应佩戴防护手套,避免污染反应体系

  5. 所有样本及耗材使用后应规范处置,防止污染环境

  6. 每次使用前应检查仪器状态,出现异常及时联系维修人员

  7. 尽量使用模板文件,提高操作一致性与数据可比性

七、常见问题与处理

问题原因分析解决措施
Ct值偏高或不一致模板浓度低、移液误差、气泡干扰重新提取模板,校验加样操作
无荧光信号荧光探针降解、通道设置错误更换探针,检查软件设置
曲线形态异常反应液污染、酶失活检查试剂有效期与保存方式
通道干扰多重PCR染料重叠调整检测通道设置或使用校正板
系统报错软件故障或硬件接触不良重启设备或联系技术支持

八、维护与校准

1. 日常维护

  • 每次使用后进行外观清洁

  • 保持仪器通风口畅通,防止过热

  • 检查电源线、USB或网络连接状态

2. 定期校准

  • 光学系统与温控模块应根据厂商推荐周期进行校准

  • 可使用赛默飞提供的校准板进行自检

  • 校准应由具备资格的人员或厂家技术支持人员执行

  • 记录每次校准与维护结果,备查

九、安全与应急处理

  • 实验操作遵守生物安全规定,使用生物安全柜处理高风险样本

  • 荧光染料避免直接接触皮肤和眼睛

  • 如遇试剂泄漏,立即使用70%乙醇或漂白剂进行清理

  • 设备发生电气故障时,立即断电并通知相关技术人员处理

  • 实验过程中如发现异常升温或烟雾,应立即停止运行并检查电源系统

十、附录:推荐PCR反应体系(以20 μL为例)

成分体积说明
2× qPCR Master Mix10 μL含酶和缓冲体系
引物(前/后)各0.4 μL最终浓度约200 nM
探针或SYBR Green0.2–0.4 μL根据染料类型选择
模板DNA1–2 μL10–100 ng
无核酸水补足至20 μL保证总体积一致