赛默飞 QuantStudio 5 荧光定量 PCR 仪操作规程

一、目的

为确保赛默飞 QuantStudio 5 实时荧光定量PCR仪的正确使用，提高实验效率，确保实验数据的准确性和重复性，特制定本操作规程。该规程适用于分子生物学、基因表达分析、核酸检测等相关实验中的PCR检测工作。

二、适用范围

本规程适用于使用赛默飞 QuantStudio 5 实时荧光定量PCR仪进行核酸扩增和荧光定量检测的实验操作人员。适用场景包括科研实验室、医疗检测机构、食品和环境检测单位等。

三、仪器简介

QuantStudio 5 是赛默飞生命科学仪器平台推出的一款实时荧光定量PCR设备，具备96孔与384孔两种格式版本。该仪器配置灵敏的荧光检测系统和高精度温控模块，配套Design and Analysis软件进行数据处理和可视化分析，支持多种应用场景。

主要技术参数：

• 检测通道：最多支持6个荧光通道

• 荧光染料兼容性：FAM、SYBR Green、VIC、ROX、Cy5 等

• 样品通量：96孔（0.2 mL）或384孔板

• 温控精度：±0.25℃

• 升降温速率：最大4.0℃/秒

• 最小检测体积：10 μL（推荐），5 μL为限

• 光学系统：独立激发和发射滤光片，快速滤片切换

• 软件平台：QuantStudio Design and Analysis 软件

• 数据输出格式：Excel、PDF、CSV等

四、使用准备

1. 仪器开机检查

• 打开主机电源，检查设备状态灯是否正常（绿色为正常）

• 确保计算机与主机通过USB或局域网连接

• 启动QuantStudio软件，登录用户账户

• 检查样品舱是否干净，无液体残留或杂质

• 确保荧光滤光片和温控板无损伤、无污染

2. 实验准备

• 准备反应体系，包括引物、探针、酶、缓冲液及模板核酸

• 样本混匀后加样至PCR板或试管中，封板并轻轻离心去除气泡

• 样本总量建议控制在10–20 μL，确保PCR反应效率

• 使用推荐的光学透明封板膜，避免荧光信号干扰

3. 模板与耗材管理

• 使用专用PCR板（0.2 mL）和光学封板膜

• 样本添加顺序应按照软件设定模板进行，确保板位与样本对应

• 样品编号应统一命名，便于后续分析追踪

• 若实验涉及多个通道检测，确保荧光染料无交叉干扰

五、操作流程

1. 实验设置

• 打开软件，点击“新建实验"

• 选择实验类型（定量PCR、熔解曲线分析、相对定量等）

• 选择荧光染料和检测通道，匹配实验方案

• 设定PCR扩增程序，如：

• 95℃ 15秒

• 60℃ 60秒（荧光采集）

• 初始变性：95℃ 10分钟

• 扩增循环（40 cycles）：

• 设定板图：将样本、阴性对照、阳性对照、标准品标注至对应孔位

• 保存方法模板文件，便于重复使用

2. 加载样品与运行

• 打开仪器样品舱，将96孔PCR板平稳放置在加热模块上

• 关闭样品舱盖，确保均匀受热

• 点击“开始运行"按钮，系统将执行程序并实时采集数据

• 实验过程中可查看扩增曲线，监测荧光信号变化

3. 实验完成与数据分析

• 实验结束后，系统自动生成Ct值表格和扩增图

• 可进行标准曲线分析、基因表达比值计算、熔解曲线分析等

• 可导出数据报告，包括Ct值、扩增效率、图表等格式

• 根据需求保存为PDF、Excel或图像文件，进行后续统计分析

4. 实验结束后的处理

• 移除PCR板并按废物处理流程处置

• 用干净棉签或无尘纸巾清洁加热模块表面

• 关闭软件与主机，切断电源，盖好防尘罩

• 核查实验记录，补充试剂使用情况与样本处理信息

六、注意事项

1. 实验期间尽量避免样品舱打开，防止温控系统紊乱

2. PCR板应均匀加样，避免气泡产生或液体溢出

3. 使用专用荧光染料，勿自行替换未验证的染料

4. 实验过程中应佩戴防护手套，避免污染反应体系

5. 所有样本及耗材使用后应规范处置，防止污染环境

6. 每次使用前应检查仪器状态，出现异常及时联系维修人员

7. 尽量使用模板文件，提高操作一致性与数据可比性

七、常见问题与处理

八、维护与校准

1. 日常维护

• 每次使用后进行外观清洁

• 保持仪器通风口畅通，防止过热

• 检查电源线、USB或网络连接状态

2. 定期校准

• 光学系统与温控模块应根据厂商推荐周期进行校准

• 可使用赛默飞提供的校准板进行自检

• 校准应由具备资格的人员或厂家技术支持人员执行

• 记录每次校准与维护结果，备查

九、安全与应急处理

• 实验操作遵守生物安全规定，使用生物安全柜处理高风险样本

• 荧光染料避免直接接触皮肤和眼睛

• 如遇试剂泄漏，立即使用70%乙醇或漂白剂进行清理

• 设备发生电气故障时，立即断电并通知相关技术人员处理

• 实验过程中如发现异常升温或烟雾，应立即停止运行并检查电源系统

十、附录：推荐PCR反应体系（以20 μL为例）