赛默飞荧光定量PCR仪注意事项

赛默飞荧光定量PCR仪（如QuantStudio系列）**时应注意的关键事项，涵盖设备使用、实验准备、数据分析、安全等方面：

一、实验准备阶段

1. 样本与试剂准备

• 样本应避免反复冻融，保持RNA/DNA质量。

• 所有试剂应解冻并混匀后再使用。

• 使用低吸附管或PCR专用耗材，减少吸附损失。

2. 反应体系设置

• 严格按照试剂说明书配制体系，注意引物、探针浓度。

• 使用去RNA酶/去DNA酶的无核酸水配制。

• 配置时操作应在冰上进行，避免酶活性变化。

3. 加样操作

• 避免气泡，影响荧光读数。

• 封板前轻轻离心，确保液体在孔底。

• 使用光学封板膜，确保贴合紧密、无褶皱。

二、仪器操作阶段

1. PCR板放置

• 保持板底清洁，避免灰尘、水渍影响检测。

• 板放入仪器前注意方向正确，与软件板图一致。

2. 通道设定

• 选择与试剂染料匹配的荧光通道。

• 若为多重检测，确保荧光染料无通道重叠。

3. 扩增程序设置

• 根据反应体系设定温度和循环参数。

• 通常荧光采集设在延伸阶段。

4. 熔解曲线（如SYBR Green）

• 启用熔解曲线分析可判断扩增特异性。

• 单一峰形代表反应特异性良好。

三、数据分析阶段

1. Ct值判断

• Ct值过高（>35）应考虑模板浓度、污染或反应效率问题。

• 无模板对照应无扩增曲线，否则怀疑污染。

2. 扩增曲线观察

• 正常扩增曲线呈“S"型。

• 曲线不规则或漂移可能因加样误差或设备问题。

3. 标准曲线分析（绝对定量）

• R²值应接近1，扩增效率在90–110%之间较理想。

四、安全与维护

1. 设备清洁

• 加热模块表面需定期擦拭。

• 避免液体流入样本槽，若有泄漏立即处理。

2. 避免交叉污染

• 区分模板制备区与扩增区。

• 使用过滤吸头，勤更换手套。

3. 试剂储存

• 酶类试剂储存于-20℃，避免频繁冻融。

• 染料类避光保存，使用后立即盖紧。

4. 数据备份

• 定期导出实验数据，避免软件崩溃造成丢失。

• 软件升级前应先备份方法与结果文件。