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发布时间：2024/11/25
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赛默飞实时荧光定量PCR仪（如ViiA™ 7、7500、QuantStudio系列）以其高精度和多功能性广泛应用于分子生物学实验。要实现高效、准确的实验结果，遵循标准化的工作流程至关重要。以下是赛默飞实时荧光定量PCR仪的详细工作流程，从样品准备到数据分析的每个环节均作了详尽说明。
核酸提取：
从细胞、组织或其他样品中提取目标DNA或RNA模板。
如果是RNA样本，需使用逆转录酶将RNA转录为cDNA。
确保核酸的纯度和浓度符合实验要求（如无抑制剂残留）。
样品定量与质量检测：
使用分光光度计或荧光计检测核酸浓度和纯度（260/280比值在1.8-2.0之间）。
通过电泳确认样品完整性。
选择试剂：
根据实验需求选择荧光染料法（如SYBR Green）或荧光探针法（如TaqMan探针）。
PCR反应混合液配制：
按以下配比准备PCR反应液（总反应体积10-50 μL）：
模板DNA或cDNA（1-100 ng）；
引物（正向和反向，引物浓度一般为200-500 nM）；
荧光染料或探针（探针浓度一般为100-200 nM）；
dNTPs、Taq DNA聚合酶和缓冲液；
去离子水补足反应体积。
分装反应液：
将PCR反应液分装至96孔或384孔光学反应板中，每孔体积一致，避免气泡产生。
进行密封（使用光学透明薄膜或封板盖）并短时间离心，使反应液集中到底部。
检查仪器是否已正确连接到电源和电脑。
打开仪器软件，确保光学模块和温控模块运行正常。
检查反应板对齐是否正确，避免样品孔偏移影响荧光信号采集。
打开仪器样品舱门，将密封好的反应板或试管架放置在托盘上。
确保反应板正确对齐，避免孔位偏移影响光学检测。
在赛默飞软件（如QuantStudio或7500软件）中进行实验设置：
实验类型选择：
绝对定量：用于精确定量目标核酸。
相对定量：用于基因表达变化分析。
熔解曲线分析：检测扩增产物的特异性或突变分析。
根据实验目标选择适合的实验类型，如：
样品信息输入：
定义样品名称、分组信息和孔位分布。
设置目标基因和参考基因的信息。
荧光通道设置：
根据荧光探针或染料选择检测通道（如FAM、VIC、SYBR Green等）。
热循环程序设置：
常规PCR循环参数如下：
变性：95℃，15秒；
退火/延伸：60℃，30秒；
初始变性：95℃，2分钟；
循环阶段（重复30-40次）：
熔解曲线分析（如适用）：从60℃升温至95℃，每0.5℃记录荧光信号。
确认所有参数无误后，点击 “运行实验"。
仪器开始循环加热并实时采集荧光信号，生成扩增曲线。
仪器完成实验后，软件会提示实验成功完成。
取出反应板并安全存放，以备后续验证或重复实验。
查看扩增曲线：
检查扩增曲线是否呈现典型的S形曲线，确认扩增反应的有效性。
平稳的S形曲线表明扩增反应正常。
Ct值计算：
Ct值（Threshold Cycle）是荧光信号达到设定阈值的循环数。Ct值越小，说明模板起始量越高。
软件会自动计算每个样品的Ct值。
标准曲线分析（用于绝对定量）：
根据标准品的Ct值绘制标准曲线，计算未知样品的浓度。
相对定量分析：
比较目标基因与参考基因的表达水平，计算相对表达量（通常使用ΔΔCt法）。
熔解曲线分析（用于SYBR Green染料法）：
检查扩增产物的特异性。单一峰值表明扩增特异性良好；多峰值可能提示非特异性扩增或引物二聚体形成。
将实验数据保存为软件支持的文件格式（如 .eds 或 .xls），便于后续分析和报告撰写。
实验完成后，用无尘布清洁样品托盘，确保无残留液体或杂质。
每周用光学专用清洁液轻轻擦拭光学窗口，避免灰尘或指纹干扰荧光检测。
每3-6个月校准一次温控模块和光学检测系统，确保仪器性能稳定。
样品制备：
确保核酸样品无污染，提取过程使用无RNase、无DNase的耗材。
模板浓度适中，避免过量或过稀导致非特异性扩增。
试剂配制：
使用新鲜的试剂，避免因试剂降解导致实验失败。
仪器环境：
将仪器放置在干燥、无振动的实验环境中，保持室内温度和湿度稳定。
操作规范：
密封反应板时，确保无气泡干扰光学检测。
运行实验时避免中途打开样品舱门。
赛默飞实时荧光定量PCR仪的工作流程涵盖样品准备、仪器设置、实验运行和数据分析等多个环节。通过严格遵守标准操作流程和注意事项，用户可以充分利用仪器的高灵敏度和高精度特点，获得可靠的实验数据。同时，定期维护和校准仪器可以确保长期稳定的性能，为实验室研究提供强有力的技术支持。
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