赛默飞QS12k型实时荧光定量PCR仪如何使用

赛默飞QS12k型实时荧光定量PCR仪（Applied Biosystems QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System）是赛默飞公司推出的一款高通量、高灵敏度的实时荧光定量PCR仪器，广泛应用于基因表达、基因分型、突变检测以及病原检测等分子生物学研究领域。以下是关于如何使用该仪器的详细步骤和注意事项。

1. 设备概述

QuantStudio 12K Flex PCR仪具备以下特点：

• 高通量支持：支持12,000个样品的实时PCR分析，适用于大规模数据采集。

• 多通道荧光检测：仪器支持最多6个荧光通道，可同时进行多重PCR反应，适用于多种荧光染料的检测。

• 灵活的实验设置：支持多种实验格式，包括96孔板、384孔板，满足不同实验需求。

• 高精度热循环系统：精准的温控系统和均匀的温度分布，确保PCR反应的一致性和可靠性。

2. 实验准备

2.1 安装与检查

在开始使用QuantStudio 12K Flex PCR仪之前，需要确保设备已正确安装并连接好所有必需的外部设备，包括电源、计算机（如果使用外部软件进行数据分析）、网络连接等。

• 位置选择：选择一个稳定的环境，避免设备受到电磁干扰、震动和温度波动。

• 仪器检查：打开设备电源后，进行自检，确保设备的硬件系统（如温控系统、荧光检测系统等）运行正常。

2.2 样品和试剂准备

• DNA模板：根据实验的目的准备DNA模板。确保模板的纯度和浓度适合定量PCR实验。

• 引物和探针：根据实验的需求，设计和准备适合的引物和探针。可以使用TaqMan探针或者SYBR Green染料等。

• PCR反应体系：通常包括DNA模板、引物、探针、荧光染料、PCR缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶等。

配制PCR反应液时，应根据所使用的试剂盒的说明书或具体实验设计，确保反应体系的准确性。

2.3 样品加载

将PCR反应混合物和模板加载到PCR板中，通常使用96孔板或384孔板。加载样品时，应避免产生气泡，确保每个孔中反应液的体积一致。

3. 设置实验程序

3.1 创建新实验

打开QuantStudio 12K Flex PCR仪的触摸屏界面或通过计算机进行操作，选择“新建实验"并进入实验设置界面。

• 选择反应板类型：选择96孔板、384孔板或其他适合实验需求的板型。

• 选择荧光染料/探针：根据所使用的实验体系，选择适合的荧光通道和染料类型（如SYBR Green、TaqMan探针等）。QS12K支持最多6个荧光通道，因此可以进行多重PCR实验。

3.2 设置热循环程序

• 热启动：根据所用的DNA聚合酶和试剂的要求，设置热启动步骤。通常在反应的初期进行热启动，以确保DNA聚合酶激活并减少非特异性扩增。

• 扩增程序：设置合适的PCR扩增循环程序，通常包括：

• 变性步骤：通常在95°C下进行约15秒，目的是分开DNA双链。

• 退火步骤：根据引物的退火温度（Tm值）设置退火温度，通常在55-65°C范围内，持续20-30秒。

• 延伸步骤：在72°C下进行，通常每个循环延伸时间为30秒到1分钟，具体时间取决于扩增片段的大小。

3.3 数据采集

在每个扩增循环的延伸阶段或退火阶段结束时进行荧光数据采集。设置合适的荧光检测时间点，确保信号的准确捕捉。

3.4 启动实验

完成所有设置后，确认无误后点击“开始实验"按钮，启动实时PCR实验。

4. 实验过程中监测

在实验进行过程中，QuantStudio 12K Flex PCR仪会实时显示PCR扩增曲线、荧光信号强度变化等数据。用户可以通过设备的显示界面实时监控实验进度。

• 扩增曲线：随着PCR反应的进行，荧光信号会逐渐增强，用户可以看到扩增曲线的变化。在适当的时间点，荧光信号超过背景信号时，称为“阈值周期"（Ct值）。Ct值的大小与初始模板的数量成反比。

• 反应板监控：如果使用多孔板，可以查看每个孔的实时扩增曲线，方便了解每个样品的反应情况。

5. 数据分析与结果

5.1 Ct值的确定

通过实时荧光信号的监测，可以获得每个样品的Ct值。Ct值代表荧光信号达到阈值时的循环数，是反应效率的一个重要指标。

• 低Ct值表示样品中目标DNA的初始量较高。

• 高Ct值表示样品中目标DNA的初始量较低。

5.2 数据导出与分析

完成实验后，用户可以通过设备的分析软件导出数据并生成实验报告。QuantStudio 12K Flex PCR仪支持多种数据分析功能，如：

• 标准曲线分析：根据标准品的Ct值与已知浓度构建标准曲线，计算样品中目标基因的拷贝数。

• 相对定量分析：使用2-ΔΔCt方法进行相对定量分析，比较不同样本间目标基因的表达量。

• 多重PCR分析：如果进行多重PCR实验，可以同时分析多个目标基因的表达或检测多个突变。

5.3 报告生成

分析完毕后，用户可以生成实验报告，报告包括各个样品的Ct值、扩增曲线、标准曲线、相对定量数据等内容。

6. 注意事项与故障排除

6.1 常见问题

• 扩增失败或Ct值异常高：可能由于模板DNA浓度过低、引物设计不当、PCR反应体系问题等导致。检查样品质量和反应体系，必要时优化引物设计。

• 非特异性扩增：出现非特异性扩增可能是由于引物退火温度设置不合适。可以通过提高退火温度来提高特异性。

• 荧光信号不稳定：检查荧光染料的浓度是否合适，避免反应液中有气泡，气泡可能导致信号的偏差。

6.2 清洁与维护

定期清洁PCR仪器，保持荧光检测窗口的清洁，避免灰尘或污染影响荧光信号的准确性。

7. 总结

QuantStudio 12K Flex实时荧光定量PCR仪具有高度的灵活性和高通量能力，适合多种分子生物学实验的需求。通过合适的实验设计、反应体系优化和数据分析，能够获得准确、可靠的实验结果。在使用时，确保设备、试剂、样品和程序设置的正确性，以获得实验效果。